转基因自消除CRISPR系统TKC2：结合RUBY报告基因实现高效无残留植物基因编辑

本文推荐一种创新的转基因自消除技术TKC2（Transgene-Killer-CRISPR version 2），通过整合RUBY可视化报告基因与多重自杀元件（CMS2/BARNASE等），在T0代实现100%转基因编辑效率，并在T1代通过颜色标记精准追踪逃逸转基因。该系统解决了传统CRISPR技术中转基因残留导致的表型干扰和监管难题，为作物功能基因组学和遗传改良提供了高效解决方案。

　　

摘要
TKC2技术通过将自杀基因模块（CMS2/ZmAA1/BARNASE）与RUBY-CRISPR单元耦合，构建了四套转基因自消除系统（TKC2.1-TKC2.4）。利用人工串联tRNA-gRNA-核酶（inTGR）结构，实现单启动子驱动Cas9、gRNA和RUBY的协同表达。在T₀代水稻中，红色表型与89.6%-95.8%的编辑效率显著相关，而T₁代绿色植株的转基因清除率达100%，全基因组测序证实无外源片段残留。

引言
传统CRISPR技术面临转基因持续存在引发的脱靶风险、表型误判和监管障碍。研究者前期开发的TKC（Transgene Killer CRISPR）技术虽能通过花粉/合子特异性自杀元件（如p35S::CMS2）清除转基因，但T₁代仍存在3%-7%逃逸率。RUBY报告基因的引入为这一难题提供突破点——其通过酪氨酸代谢途径产生红色贝塔拉宁，无需化学处理即可直观标记转基因表达。

结果

1. RUBY-CRISPR耦合设计
   采用CmYLCV强启动子驱动inTGR-Cas9-RUBY融合基因，内源RNase P/Z和HDV核酶精确释放gRNA。T₀代红色植株编辑效率（89.6%）显著高于绿色植株（69.7%），且红色表型与Cas9活性呈正相关。

2. 四元自杀系统优化
   TKC2.1（CMS2+REG2::BARNASE）表现最优，T₁代转基因清除率99.4%；而TKC2.4（ZmPG47::ZmAA1+NF-YB1::BARNASE）因胚乳特异性启动子效率不稳定，清除率降至73.6%。全基因组测序显示，100%绿色T₁植株无T-DNA残留，但转基因阳性植株仍存在嵌合突变。

3. 表型-基因型关联验证
   以水稻SE5（光周期敏感基因）和YSA（幼苗白化基因）为靶点，红色T₀植株均呈现预期表型：se5突变体早花，ysa突变体三叶期白化。T₁代绿色植株中，-21bp缺失等编辑类型稳定遗传，未发现新发突变。

讨论
该技术突破传统抗生素筛选局限，实现"肉眼可见"的转基因追踪。自杀元件时空特异性激活是关键——花粉特异性ZmPG47启动子驱动α-淀粉酶（ZmAA1）破坏淀粉代谢，而合子特异性REG2启动子确保转基因合子致死。未来可拓展至多倍体作物，但需注意嵌合体导致的突变复杂性。

材料与方法
选用粳稻品种中花11，通过农杆菌介导法转化。构建采用Gibson组装技术，自杀元件通过重叠PCR拼接。突变检测采用SalI/EagI酶切法和Sanger测序，全基因组测序深度≥8.15Gb，经Fastp质控和BWA比对验证。