基于TdT/Cas12a级联放大系统的精子冷冻损伤DNA断点高敏检测技术及其在抗氧化保护机制研究中的应用

本研究针对精子冷冻保存过程中DNA完整性评估的技术瓶颈，开发了基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和CRISPR-Cas12a的级联放大生物传感器。该技术通过TdT介导的polyA尾延伸和Cas12a反式切割活性，实现了0.001 nM检测限的DNA断点精确定量，较传统SCSA和TUNEL方法灵敏度提升10倍。研究发现冷冻过程显著增加精子DNA断点数量(2.93×105/DNA链)，而添加白藜芦醇(RES)的冷冻保护剂可有效维持DNA完整性。该成果为优化辅助生殖技术(ART)冷冻方案提供了分子级评估工具。

　　

在辅助生殖技术快速发展的今天，精子冷冻保存已成为生育力保存的核心技术。然而冷冻过程中的氧化应激和冰晶形成会导致精子DNA损伤，这不仅影响受精成功率，更可能对后代健康埋下隐患。传统检测方法如精子染色质结构分析(SCSA)和末端标记法(TUNEL)存在灵敏度不足、操作复杂等问题，难以精确评估分子水平的DNA损伤。这一技术瓶颈严重制约了冷冻保护方案的优化进程。

宁夏医科大学总医院生殖医学中心的研究团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究。该团队创新性地将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的核苷酸延伸能力与CRISPR-Cas12a的核酸识别特性相结合，开发出具有单分子检测灵敏度的DNA断点生物传感器。研究通过32例临床样本验证，首次实现了冷冻损伤DNA断点的精确定量，并发现天然抗氧化剂白藜芦醇对DNA完整性具有显著保护作用。

关键技术包括：1）建立TdT介导的polyA尾延伸体系，通过电泳验证延伸效率；2）优化Cas12a/crRNA复合物比例(20 nM/10 nM)实现信号放大；3）开发标准曲线定量模型(Y=165.48X+0.1447，R²=0.9912)；4）采用计算机辅助精液分析(CASA)和SCSA进行方法学对比；5）评估不同冷冻保护剂(含RES/LBP)对DNA断点均值(MDB)的影响。

【检测原理】
研究团队设计的级联放大系统巧妙利用两个生物分子工具的特性：TdT酶能识别DNA断点的3'-羟基末端并延伸polyA尾，而Cas12a在crRNA引导下特异性结合polyA序列后激活反式切割活性，通过切割荧光报告基团(FAM-BHQ1)产生信号。

【方法验证】
电泳分析显示TdT延伸polyA尾的效率显著优于其他核苷酸(图2A)，其信噪比(62.8)较polyT提高3倍。标准曲线验证表明系统在0.001-0.2 nM范围内呈良好线性，日内精密度(RSD 2.27-3.91%)满足临床检测要求。

【临床应用】
在冷冻-复苏样本检测中，传统SCSA显示的DNA碎片指数(DFI)无显著变化，而TdT/Cas12a系统检测到MDB值显著升高(p<0.05)。特别值得注意的是，添加30 μmol/L RES的冷冻组MDB值与新鲜精子无统计学差异，证实其DNA保护效果。

讨论部分指出，该研究首次实现冷冻损伤DNA断点的分子级量化，揭示传统DFI评估可能低估实际损伤程度。相比TUNEL仅能检测阳性细胞比例，新系统可精确计算单条DNA链的断点数量(2.93×10⁵)，为优化冷冻方案提供直接依据。白藜芦醇的保护效应提示抗氧化途径是减少冷冻损伤的有效策略。

这项技术的突破性在于：1）灵敏度较TD-probe技术提升10倍；2）建立首个精子DNA断点绝对定量标准；3）为抗氧化剂筛选提供精准评估工具。研究成果不仅推动生殖医学检测技术发展，更为提高辅助生殖成功率及保障后代健康奠定基础。未来可拓展至不孕症诊疗、环境毒理学评估等领域，具有广阔的临床应用前景。