SpCas12f1同源二聚体介导的DNA顺序切割机制与结构基础解析

本研究揭示了Syntrophomonas palmitateca来源的Cas12f1（SpCas12f1）通过同源二聚体结构实现DNA顺序切割的分子机制。研究人员结合冷冻电镜结构与单分子磁镊技术，发现SpCas12f1形成18 bp R-loop（R环）并通过单一催化中心依次切割非靶链（NTS）和靶链（TS），为微型CRISPR-Cas系统的基因组编辑应用提供了关键理论依据。

　　

在基因组编辑技术飞速发展的今天，微型CRISPR-Cas系统因其体积小巧（可适配腺相关病毒AAV载体）而备受关注。然而，作为V-F型代表的Cas12f1效应复合物，其DNA识别与切割的动态协调机制始终蒙着神秘面纱。传统Cas12家族成员（如Cas12a）以单体形式发挥作用，而Cas12f1却另辟蹊径——它需要形成(Cas12f1)₂(RNA)₁同源二聚体才能行使功能。更令人费解的是，这个仅400-600个氨基酸的"小个子"竟能通过单一催化中心完成三次DNA切割（非靶链两处、靶链一处），这种精妙的分子编排机制成为领域内亟待破解的科学谜题。

来自德国莱比锡大学（Universit?t Leipzig）和立陶宛维尔纽斯大学（Vilnius University）的联合团队在《Nucleic Acids Research》发表重要成果。研究人员采用冷冻电镜解析了SpCas12f1与sgRNA、靶DNA的三元复合物结构（分辨率2.8 ?），并结合单分子磁镊实时观测DNA切割过程，通过磷酸硫代修饰的DNA底物系统分析了切割位点特异性。

【关键技术方法】

1. 冷冻电镜（cryo-EM）解析SpCas12f1-sgRNA-DNA复合物结构
2. 单分子磁镊技术定量R-loop形成动力学（0.3-3 pN力场）
3. 磷酸硫代修饰的变性PAGE分析切割位点
4. HEK293T细胞基因组编辑效率检测（Illumina测序）

【主要研究结果】

Overall structure of SpCas12f1 nuclease

冷冻电镜结构显示SpCas12f1二聚体中，主要亚基（Subunit 1）负责PAM识别（5'-TTC-3'）和靶链结合，次要亚基（Subunit 2）通过REC结构域稳定R-loop。与预测不同，工程化缩短的sgRNA（最小保留核心茎环结构）仍保持编辑活性，其中"头尾相连"茎（head-to-toe stem）的改造使HEK293T细胞编辑效率提升2倍。

DNA-RNA heteroduplex formation and PAM recognition

R-loop长度被精确控制在18 bp，其末端通过RuvC.2亚基242-245位残基的碱基堆叠作用稳定。PAM识别关键残基Y72通过氢键和范德华力特异性识别胸腺嘧啶甲基（5'-NTTN-3'基序）。

Characterization of R-loop formation and stability

单分子实验揭示：18 nt spacer形成的R-loop稳定性最高（90%保持率），而14/24 nt spacer的R-loop易解离。中间态R-loop（约8 bp）寿命仅数秒，反映RuvC.1亚基与靶链7-10 nt区域的动态结合。

dsDNA cleavage is preceded by rapid cleavage of one of the strands

磁镊数据显示：非靶链切割（~7秒）比靶链切割（~213秒）快30倍。46%的分子在非靶链切割后出现"钳制"现象（clamping），但靶链切割却发生在DNA松弛状态，这与Cas12a的机制截然不同。

SpCas12f1 cleaves NTS and TS in a sequential manner

磷酸硫代修饰实验证明：非靶链切割位点具有惊人灵活性（13-24 nt间任意位置），而靶链切割严格依赖非靶链的预先切割。当非靶链8-28位全修饰时，靶链切割效率下降80%，但引入单链切口可完全恢复活性。

【结论与意义】
该研究首次阐明SpCas12f1通过"先非靶链后靶链"的顺序切割机制：① 柔性非靶链快速进入RuvC.1催化中心被随机切割；② 切割后的非靶链解离，使靶链能够环化进入催化中心；③ PAM远端DNA双链的瞬时解旋促进靶链切割。这种机制解释了微型Cas12f1如何用单一催化中心实现多重切割，其结构动态数据为设计更高效的基因组编辑工具提供了关键参数：

1. 18 nt spacer设计的R-loop最稳定
2. "头尾相连"茎改造可增强sgRNA效率
3. 非靶链切割区的柔性设计可能提升编辑活性
   研究揭示的 staggered切割模式（非靶链切除12 bp片段）为定向DNA片段插入提供了新思路，将推动AAV递送的微型CRISPR系统在基因治疗中的应用。