扩展Vibrio natriegens基因工程能力：Vnat Collection工具包的创新与应用

本刊推荐：研究人员针对海洋细菌Vibrio natriegens遗传工具不足的瓶颈，开发了Vnat Collection工具包。通过优化Golden Gate克隆、引入正交诱导启动子（如PTet和PTac）、设计新型操作子连接器及改进NT-CRISPR工作流程，实现了组装效率提升300倍、基因组编辑周期缩短至4天。该研究显著扩展了V. natriegens在合成生物学和代谢工程中的应用潜力，为高效生物制造底盘开发树立了新标准。

　　

在合成生物学领域，寻找高效、可定制的微生物底盘一直是科学家的梦想。Vibrio natriegens以其惊人的倍增速度（<10分钟）和强大的代谢能力脱颖而出，被誉为"下一代生物制造引擎"。这种海洋细菌能在高盐环境中茁壮成长，理论上可大幅提升生物反应器效率。然而，其潜力长期受限于遗传工具的匮乏——启动子调控不精确、多基因组装繁琐、基因组编辑耗时长，如同给超级跑车套上了马车轮。传统工具如Marburg Collection虽提供了基础框架，但组装错误频发、正交控制薄弱，限制了复杂代谢通路的构建。更令人头疼的是基因组编辑技术NT-CRISPR，需经历PCR纯化、多步克隆等繁冗流程，耗费一周才能获得一个编辑菌株。这些问题如同枷锁，禁锢了V. natriegens在生物燃料、药物合成等领域的应用突破。

为打破这一僵局，西澳大利亚大学（University of Western Australia）的Georg Fritz团队领衔开发了Vnat Collection。研究首先利用Golden Gate克隆（GGA）优化质粒组装策略，通过流式细胞术筛选启动子活性；其次结合CRISPR-Cas9系统改造NT-CRISPR工作流程，采用工程化着陆垫（landing pad）菌株实现双荧光筛选；最后通过启动子剂量响应曲线和生长动力学分析评估工具性能，所有实验在LBv2和MOPS2培养基中完成，菌株源自V. natriegens DSMZ 759突变体（△VNP1+2和△dns）。

增强启动子控制

研究团队测试了9种诱导启动子（包括P_Ttg、P_Cin+1等），在M9培养基中通过mScarlet-I报告基因定量活性。结果显示P_Tet、P_Tac和P_3B5B表现出最高正交性（>1000倍诱导），而P_PhIF和P_Sal因本底泄露被淘汰。有趣的是，萘黄酮（naringenin）和酰基高丝氨酸内酯（OHC₁₄）等诱导剂意外激活非目标启动子，暗示其在V. natriegens中可能参与群体感应信号通路。

新型操作子连接器

为解决多基因共表达难题，团队设计了5'和3'操作子连接器，成功组装五基因脱氧紫色杆菌素（deoxyviolacein）通路。在P_Tet启动子驱动下，质粒pVC_L2_Operon同时表达vioA、vioB、vioE、vioC和sfGFP，紫色色素合成与绿色荧光蛋白（sfGFP）信号同步增强（30倍诱导），证明该设计可协调代谢通量。

改进的Dropout组件

通过替换限制酶策略（BsaI用于组装、BpiI用于替换），dropout质粒组装效率提升300倍。测试中，八组件质粒改用两组件dropout预装系统后，菌落形成单位（CFU）从10²增至10⁴，大幅降低复杂构建门槛。

高效NT-CRISPR工作流程

创新性地在七个基因组位点（如araA、vps）插入着陆垫（含P_Tet-mScarlet-I报告单元），结合未纯化的Golden Gate产物作转化DNA（tDNA）。结果显示：环状质粒编辑效率达97.5%，且△vps突变体在醋酸培养基中生长速率提升21%。更关键的是，araA缺失使阿拉伯糖启动子P_BDA敏感性提高5000倍，仅需1μg/ml即可完全诱导。