动态共价脂质纳米颗粒介导CRISPR-Cas9基因编辑治疗小鼠脉络膜新生血管的研究

推荐：本研究针对抗VEGF疗法治疗脉络膜新生血管(CNV)存在的响应率低、患者依从性差等问题，开发了基于亚胺硼酸酯动态共价键的脂质纳米颗粒(LNP-A4B3C7)，通过共递送Cas9 mRNA(mCas9)和靶向VEGFA的sgRNA(sgVEGFA)，实现了视网膜色素上皮细胞中H2O2触发的纳米颗粒解离和高效基因编辑，单次玻璃体内注射即可显著减少CNV面积，为CNV治疗提供了新型非病毒递送平台。

　　

脉络膜新生血管(CNV)是湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)的主要病理特征，目前临床主要通过玻璃体内注射血管内皮生长因子A(VEGFA)抑制剂进行治疗，但存在响应不完全、需频繁注射导致眼内并发症等问题。基因编辑技术为CNV治疗提供了新思路，但病毒载体存在免疫原性风险，而非病毒递送系统又面临转染效率低和胞内释放不足的挑战。

苏州大学的研究人员创新性地设计了一种基于动态共价化学的解决方案。他们通过"一锅法"三组分反应合成了一系列含亚胺硼酸酯结构的可电离阳离子脂质体(lipidoid)，其中最优配方LNP-A₄B₃C₇能高效共递送Cas9 mRNA(mCas9)和靶向VEGFA的单链引导RNA(sgVEGFA)。这项突破性研究发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为解决CNV治疗难题提供了新策略。

研究采用的主要技术包括：1)高通量脂质体库构建与筛选；2)激光诱导CNV小鼠模型建立；3)活体生物发光成像监测基因表达；4)下一代测序(NGS)分析基因编辑效率；5)荧光血管造影评估治疗效果。

【合成与筛选】研究人员首先通过迈克尔加成反应合成9种二醇封端脂质尾(C₁-C₉)，再与不同胺头基(A)和甲酰苯基硼酸(B)通过动态共价反应构建脂质体库。在HeLa细胞筛选中，C₇脂质尾表现出最佳mRNA转染效率，其中LNP-A₄B₃C₇在氧化应激条件下的ARPE-19细胞中转染效率显著高于商品化试剂Lipofectamine 2000(Lpf2k)和FDA批准的LNP-ALC-0315。

【特性表征】核磁共振证实LNP-A₄B₃C₇中亚胺键(C=N)在酸性条件下断裂，苯硼酸 linker在H₂O₂作用下氧化降解。荧光共振能量转移(FRET)和透射电镜显示，H₂O₂处理导致纳米颗粒解离，24小时内mRNA释放率达80%。这种双重响应特性使其能在CNV病灶的高氧化应激环境中高效释放基因编辑组件。

【细胞机制】在激光诱导的CNV小鼠模型中，玻璃体内注射的LNP-A₄B₃C₇通过Müller细胞的转胞吞作用跨越内界膜，12小时内即可到达视网膜色素上皮层。共聚焦显微镜显示，氧化应激促进纳米颗粒在胞内解离，使mCas9/sgVEGFA的基因编辑效率达70.4%，显著降低VEGFA表达(71.4%)和分泌(73.4%)。

【治疗效果】在激光诱导CNV模型中，单次注射mCas9/sgVEGFA@LNP-A₄B₃C₇可使VEGFA基因敲除率达57%，CNV面积减少76.4%，效果与临床药物aflibercept相当。在二次激光激发模型中，基因编辑组的治疗效果持续存在，而aflibercept组失去保护作用，证实了该策略的长期疗效优势。

这项研究的重要意义在于：1)开发了简便高效的动态共价脂质体合成方法；2)构建了具有微环境响应性的非病毒基因递送系统；3)证实了玻璃体内注射即可实现视网膜深层的基因编辑；4)为CNV等眼底疾病提供了具有转化潜力的治疗新策略。该技术平台还可拓展应用于其他遗传性和获得性眼病的治疗研究。