通过基因编辑和蛋白质工程改良马铃薯块茎贮藏蛋白patatin的热稳定性研究

本研究针对马铃薯贮藏蛋白patatin在酸性条件下热稳定性差的问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和蛋白质工程手段，对马铃薯patatin基因簇进行改造并设计热稳定突变体。研究人员发现特定sgRNA可实现对10%以上patatin等位基因的编辑，并通过异源表达验证了pH稳定性改善的突变体，为马铃薯蛋白的工业化提取提供了新思路。该成果发表于《Planta》。

　　

马铃薯作为全球第四大粮食作物，其块茎中富含一种名为patatin的贮藏蛋白，这种蛋白不仅营养价值高，还具有优异的发泡性能，是理想的植物蛋白来源。然而在淀粉加工过程中，patatin的低热稳定性成为制约其工业化应用的瓶颈——在28°C就会发生部分解折叠，在酸性条件下更易失活。目前从马铃薯果汁（PFJ）中提取的蛋白因含有有毒的糖苷生物碱，大多只能用作饲料。如何提高patatin的热稳定性，使其能够耐受工业提取过程中的高温和酸性条件，成为研究人员亟待解决的问题。

瑞典农业科学大学（Swedish University of Agricultural Sciences）的研究团队在《Planta》发表了一项创新性研究。他们采用多学科交叉的方法，首先通过RNA测序分析了两个马铃薯品种（Desirée和Kuras）块茎中patatin基因的表达谱，发现虽然基因组中存在21个patatin基因拷贝，但实际表达的只有少数几个，且多数预测为催化失活型。随后利用CRISPR/Cas9系统，设计特异性sgRNA靶向patatin基因簇的保守区域，在原生质体转化实验中实现了10-15%的等位基因编辑效率。基于蛋白质结构预测和约束网络分析（CNA），研究人员设计了四个patatin突变体（M1-M4），通过大肠杆菌异源表达和差示扫描荧光法（DSF）评估其热稳定性。

研究采用了多项关键技术：RNA测序分析patatin基因表达谱；CRISPR/Cas9介导的基因编辑；原生质体转化和突变体筛选；蛋白质结构预测和稳定性分析；大肠杆菌异源表达系统；差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白质热稳定性。

研究结果部分：
"Tuber expression of patatin genes in cultivars Desiree and Kuras"：RNA测序显示两个栽培品种的patatin表达模式存在显著差异，19个基因中仅有部分高表达，且多数携带使酶失活的S77G突变。Desirée中Pat-6表达量最高（TPM 4159.96），而Kuras中Pat-2表达占优（TPM 1078.43）。

"Gene editing of patatin genes in cv Desirée"：通过HRFA和扩增子测序证实，设计的sgRNA能有效编辑10-15%的patatin等位基因。有趣的是，与sgRNA存在单碱基错配的等位基因编辑效率显著高于完全匹配的等位基因。

"Patatin protein modeling and design of amino acid exchanges"：基于Solanum cardiophyllum pat17（1oxw）晶体结构，预测出两个关键的解折叠核心区域。设计的四个突变体中，M1引入二硫键（T78C/D215C），M2增加氢键（S154V等6个突变），M3引入更多二硫键，M4在柔性环区添加芳香族氨基酸簇（M192F等3个突变）。

"Stability of designed patatins"：DSF分析显示，野生型patatin在pH5（接近其等电点）时热稳定性最差（Tm降低）。突变体M4表现出独特的双相熔解曲线，且在三种pH条件下稳定性最为均衡，而其他突变体热稳定性均不及野生型。

研究结论指出，虽然设计的patatin突变体未能显著提高热稳定性，但获得了重要的发现：首先证实了通过单一sgRNA可同时编辑多个patatin基因拷贝，为后续精准编辑奠定基础；其次发现M4突变体具有独特的pH稳定性，是进一步优化的理想候选。这些发现为通过蛋白质工程改良植物贮藏蛋白提供了新思路，未来结合糖基化修饰等策略，有望开发出更适合工业提取的patatin变体。该研究不仅对马铃薯蛋白的开发利用具有重要意义，也为其他作物贮藏蛋白的改造提供了可借鉴的技术路线。