新型NOD SCID小鼠模型N2G的构建：基于CRISPR/Cas9技术实现Il2rg和Prkdc基因近全缺失及其在人类癌症与造血干细胞移植研究中的应用

本研究针对现有免疫缺陷小鼠模型（如NSG/NOG）中残留突变mRNA和截短蛋白干扰实验结果的难题，通过CRISPR/Cas9技术构建了Prkdc和Il2rg基因近全缺失的N2G小鼠。该模型成功支持人类肿瘤异种移植和CD34+脐血造血干细胞（HSC）的免疫细胞重建，特别是显著提升T细胞功能，为肿瘤免疫治疗和人类免疫系统研究提供了更精准的平台。

　　

在生物医学研究中，免疫缺陷小鼠模型是探索人类疾病机制和药物开发的"黄金标准"。然而，现有主流模型如NSG（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wj）和NOG（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug）小鼠存在基因改造不彻底的问题——这些模型通过胚胎干细胞基因打靶技术构建时，Il2rg基因被新霉素抗性（Neo） cassette替换，可能导致邻近基因表达异常；同时残留的突变mRNA可能逃逸无义介导的降解（NMD），产生具有残余活性的截短蛋白，影响实验结果的可靠性。

为解决这一技术瓶颈，韩国延世大学（Yonsei University）的研究团队采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在NOD小鼠品系上开发了新型N2G（NOD-2-Genes KO）模型。该研究通过设计靶向Prkdc基因第3/86外显子和Il2rg基因启动子/第8外显子的双向导RNA，实现了193kb的Prkdc区域和4kb的Il2rg区域近乎完全的基因组删除，从根源上消除了残留转录本和蛋白产物的干扰。相关成果发表在《Transgenic Research》期刊。

研究主要采用四项关键技术：1）CRISPR/Cas9介导的大片段基因删除；2）多种人类癌细胞系（A549、MDA-MB-231等）的异种移植评估；3）人源化模型构建（CD34⁺脐血造血干细胞移植）；4）多参数流式细胞术分析免疫细胞重建效率。所有实验均使用特定病原体（SPF）级动物设施，并遵循三星医学中心伦理委员会批准的脐血样本采集协议。

Generation of N2G mice with extensive deletion of Prkdc and complete deletion of Il2rg genes

通过PCR和RT-qPCR验证显示，N2G小鼠骨髓、脾脏和胸腺中Prkdc和Il2rg mRNA完全消失，而NSG小鼠随年龄增长出现基因表达"泄漏"。这种彻底的基因删除避免了DNA-PKcs截短蛋白的DNA结合干扰和γc受体残余信号传导。

Tumor engraftment in N2G mice

在A549肺癌细胞移植实验中，N2G与NOG小鼠肿瘤体积无显著差异，但N2G小鼠肺转移结节数量（1-2mm大小）显著增加（25 vs 9个，p<0.001）。MDA-MB-231乳腺癌模型也观察到类似的肝肺转移倾向，证明N2G更适合转移研究。

Generation of humanized N2G(hu-N2G) mice with human CD34⁺ CB cell transplantation

30mg/kg白消安预处理后，hu-N2G外周血hCD45⁺白细胞和hCD3⁺ T细胞比例显著高于hu-NSG（p<0.01）。脾脏组织学显示更强的hCD3⁺ T细胞浸润，而hCD19⁺ B细胞重建与NSG相当。

Cytokine response of splenic human cytotoxic immune cells

IL-12/IL-15刺激后，hu-N2G的hCD8⁺IFN-γ⁺ T细胞反应强度显著提升（p<0.001），NK细胞功能也增强，证实删除Il2rg后重建的免疫细胞仍保持细胞因子敏感性。

Cell proliferation capacity of splenocytes

CFSE增殖实验显示hu-N2G的hCD3⁺和hCD8⁺ T细胞分裂速度更快，表明N2G环境更有利于人类T细胞扩增。

该研究首次实现免疫缺陷关键基因的近乎完全删除，解决了传统模型因残留基因产物导致的实验变异问题。N2G小鼠在保持肿瘤支持能力的同时，显著提升人类T细胞重建效率，这对CAR-T治疗评估和肿瘤免疫研究具有突破性意义。研究者特别指出，该模型避免了Neo cassette的基因组位置效应，为精准医学研究提供了更纯净的遗传背景。未来可进一步探索该模型在自身免疫疾病、感染免疫等领域的应用潜力。