功能冗余的Rho GTP酶Cdc42与RacA通过调控形态发生、氧化平衡和能量代谢影响黄曲霉产毒与致病性

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术（效率达单基因95%/双基因75%）揭示了黄曲霉（Aspergillus flavus）中Rho GTPases家族成员Cdc42与RacA的功能冗余性及其协同调控机制。研究发现这两个高度保守的分子开关通过调控NADPH氧化酶（Nox）活性影响活性氧（ROS）平衡，同时通过脂肪酸β-氧化和丙酮酸代谢调控乙酰辅酶A（acetyl-CoA）生成，进而影响黄曲霉的形态建成、细胞壁完整性、黄曲霉毒素（AFB1/AFB2）合成及宿主侵染能力。该研究为防控黄曲霉毒素污染提供了新靶点。

　　

基因编辑技术突破与菌株构建
研究团队创新性地利用5S rRNA启动子和tRNA-gRNA串联阵列系统开发了高效CRISPR/Cas9编辑平台，在黄曲霉中实现单基因编辑效率超95%（wA/yA基因），双基因编辑效率达75%（wA/pyrG基因）。通过该系统成功构建了Δcdc42和ΔracA单基因缺失株，但未能获得双敲除株，暗示二者功能冗余且双缺失致死。采用四环素诱导系统构建的Δcdc42racA_tetOn条件突变体在无多西环素时完全不能生长，验证了这一假设。

保守蛋白的结构与进化特征
生物信息学分析显示，黄曲霉Cdc42（AFLA_129910）与RacA（AFLA_102810）具有64.2%的序列同源性，均含有典型的GTP结合/水解结构域、效应结构域、膜定位基序和Rho插入域。系统发育分析表明二者在丝状真菌中高度保守，但在酿酒酵母（S. cerevisiae）中未发现RacA同源物，提示其在多细胞真菌形态复杂性进化中的特殊作用。

形态发生的双向调控机制
突变体表现出显著的形态异常：Δcdc42菌落直径最小（减少23%），ΔracA产孢量最低（下降65%）。荧光显微观察发现Δcdc42菌丝尖端存在固醇富集膜域（SRD）但菌丝弯曲，而ΔracA完全丧失SRD极性分布。值得注意的是，突变体分生孢子萌发时间显著提前，6小时萌发率即达WT的2.3倍，这与水解酶活性增强和ATP水平升高（提升42%）相关。核染色显示Δcdc42单位菌丝长度内核数量增加37%，提示其细胞周期调控异常。

次级代谢网络的重编程
在基本培养基中，Δcdc42和ΔracA的黄曲霉毒素B₁（AFB₁）产量分别骤降120倍和400倍。转录组分析显示21个毒素合成基因（aflR/aflS等）显著下调，而抗氧化剂曲酸（KA）产量增加2.8倍。细胞毒素CPA合成也受抑制，但在营养丰富的YES培养基中这些表型可部分恢复，表明存在营养依赖的替代调控通路。酵母双杂交证实Cdc42/RacA与NADPH氧化酶调控亚基NoxR互作，通过调节ROS平衡影响次级代谢。

致病力的多维衰减
透射电镜显示突变体在花生表面的菌丝变薄塌陷，侵染7天后产孢量降低50-100倍，且完全检测不到AFB₁。96孔板粘附实验显示突变体生物膜形成能力下降61%（48小时）。这种致病缺陷源于：①细胞壁组分改变（几丁质减少33%，β-1,3-葡聚糖下降28%）；②氧化应激响应受损（SOD活性降低54%）；③机械穿透力丧失。

能量代谢的拮抗调节
JC-1染色显示突变体线粒体膜电位（Δψm）升高，ATP产量增加35%。有趣的是，Cdc42与RacA在脂代谢中呈现相反作用：Δcdc42中脂肪酸β-氧化相关基因下调导致脂滴（LDs）积累增加，而ΔracA中该通路上调使乙酰辅酶A水平升高27%。这种代谢重编程通过影响乙酰辅酶A库容，进而调控聚酮体毒素合成前体的供应。

潜在应用价值与展望
该研究阐明Cdc42/RacA通过"形态发生-氧化平衡-能量代谢"三位一体的调控网络控制黄曲霉的毒力特征。针对这两个关键靶点的抑制剂开发，可能为同时阻断真菌侵染和毒素积累提供"一石二鸟"的防控策略。特别值得注意的是，二者在人类病原真菌（如白色念珠菌）中的同源物也参与致病过程，提示该发现可能具有更广泛的抗真菌药物开发价值。