CRISPR/Cas9介导的大麦脂氧合酶基因编辑促进谷物脂肪酸积累与储存稳定性研究

本研究通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑大麦脂氧合酶（LOX）基因家族成员HvLOXA、HvLOXB和HvLOXC1，成功获得无外源基因的纯合突变体。研究发现，双突变体loxAloxC1的成熟籽粒LOX活性降低94%，脂肪酸含量显著增加10-21%，且人工老化处理后发芽率提升12-23%，为改善谷物营养价值和储存稳定性提供了创新策略。

　　

大麦脂氧合酶基因家族的鉴定与表达特征

通过基因组分析在大麦中鉴定出5个LOX基因（HvLOXA、HvLOXB、HvLOXC1-3），系统发育显示HvLOXC1-3聚为一簇，而HvLOXA位于HvLOXB与HvLOXC之间。RT-qPCR揭示HvLOXC1在早期发育籽粒中表达最高，HvLOXA在胚胎中占主导，HvLOXB和HvLOXC3则普遍低表达。这种组织特异性模式暗示各成员功能分化，其中HvLOXC1可能主导籽粒发育初期的LOX活性调控。

CRISPR/Cas9靶向编辑与突变体创制

设计6条gRNA靶向HvLOXA/B/C1的编码区，构建多tRNA-gRNA载体并通过农杆菌转化大麦"Golden Promise"。T₀代突变效率达48-64%，经筛选获得T₁代无Cas9的纯合突变体，包括loxB（单碱基插入/缺失）、loxC1（3-5 bp缺失）和loxAloxC1（双基因突变）。测序证实突变均位于PAM序列上游3-4 bp处，导致翻译提前终止（如loxB7-12的D298和loxC10-1的L11）。

突变体的表型与生化特征

尽管所有突变体株高、分蘖数正常，但loxC1和loxAloxC1的千粒重显著降低5-13%。成熟籽粒中，loxAloxC1的LOX活性骤降94%，且MDA含量减少25-37%。GC-MS分析显示双突变体脂肪酸总量提升20.7%，其中棕榈酸（C16:0）和亚油酸（18:2）增幅达41.2%和20.7%，表明HvLOXA在脂肪酸代谢中的核心作用。

人工老化处理的抗逆性提升

40°C/85%湿度条件下，loxAloxC1经15天老化后LOX活性近乎归零，发芽率较野生型提高23%，幼苗根长显著增加。这种表型与LOX介导的脂质过氧化抑制直接相关，证实双突变通过减少细胞膜损伤和毒性代谢物积累来增强储存稳定性。

应用前景与育种价值

研究首次实现大麦LOX基因家族的多靶点编辑，揭示HvLOXA/HvLOXC1协同调控脂肪酸代谢与储存耐受性的机制。双突变体可作为优质种质资源，通过杂交育种将低LOX特性导入经济品种，为谷物营养强化和采后损失控制提供新思路。