电转染结合手工克隆技术高效编辑山羊胚胎中BMP15/GDF9/MSTN基因（CLPG印记基因除外）的研究

为解决传统育种中基因组混合问题，研究人员采用双gRNA-CRISPR/Cas9策略，通过优化电转染参数（270V脉冲×2）和手工克隆技术（SCNT），成功实现山羊胚胎中BMP15/GDF9/MSTN基因的高效编辑（突变率78-97%），但印记基因CLPG编辑效率仅30%。该研究为家畜精准育种提供了新范式。

　　

这项突破性研究展示了如何利用电转染结合手工克隆技术在山羊胚胎中实现精准基因编辑。科研团队采用双向导RNA（dual gRNA）的CRISPR/Cas9系统，针对繁殖相关基因骨形态发生蛋白15（BMP15）和生长分化因子9（GDF9），以及肌肉发育关键基因肌肉生长抑制素（MSTN）和callipyge（CLPG）展开靶向编辑。

通过优化电转染体系——使用含10-20μg质粒DNA的250μL OptiMEM-GlutaMAX溶液，对百万级山羊成纤维细胞施加两次270伏特、10毫秒的脉冲刺激，成功实现高效基因编辑。经手工体细胞核移植（SCNT）技术，包括人工去核和卵母细胞-供体细胞融合等关键步骤，成功获得克隆胚胎。

测序结果显示，BMP15、GDF9和MSTN三个基因表现出惊人的编辑效率（78-97%），且以双等位基因编辑为主。特别值得注意的是，在MSTN基因编辑中，3'端具有7个碱基重叠序列的gRNA表现出超高活性。然而，受表观遗传调控的印记基因CLPG却表现出明显抗性，编辑效率仅约30%。

虽然着丝粒附近基因（metacentric）和端粒区域基因（telomeric）的总体编辑效率无显著差异，但前者发生靶向缺失的概率（43%）显著高于后者（20%）。令人振奋的是，基因编辑并未影响胚胎发育率，与未编辑对照组相当。这些发现不仅证实了电转染-SCNT联用技术在非印记基因编辑中的卓越性能，更为突破印记基因编辑壁垒指明了新的研究方向。