嗜热栖热菌高效蛋白表达底盘细胞的首次构建及功能验证

本研究针对嗜热栖热菌（Thermus thermophilus HB27）作为高温稳定蛋白表达平台的瓶颈——强启动子稀缺和蛋白酶降解问题，通过筛选天然启动子库（P0984活性提升13倍）、构建质粒游离型菌株（HB27△pTT27实现基因组精简270 kb），并系统性敲除16个蛋白酶基因（发现TTC0264与TTC1905为关键胞外蛋白酶），最终获得多基因编辑菌株DSP9（10个蛋白酶缺失）。该菌株在保持生长活力的同时，使报告蛋白β-半乳糖苷酶表达量提升2倍，为高温环境下异源蛋白生产提供了高效、低降解的工程化底盘细胞。

　　

论文解读

在生物能源与可持续工业领域，热稳定性酶（如纤维素酶、漆酶）的高效生产面临关键瓶颈：传统大肠杆菌表达系统难以正确折叠高温蛋白，且存在聚集、降解风险。嗜热栖热菌HB27凭借75℃的最适生长温度成为理想宿主，但其应用受限于强启动子工具匮乏及内源蛋白酶对异源蛋白的降解。针对这一挑战，华中农业大学的科研团队在《Microbial Cell Factories》发表突破性研究，通过多维度工程改造首次构建出高效蛋白表达底盘细胞。

研究团队采用三大关键技术：1) 基于内源β-半乳糖苷酶（TTP0042）的报告系统筛选13个天然启动子；2) 利用CRISPR-Cas I-B系统（质粒pRKP31-AC3介导）完成基因组编辑（包括270 kb巨型质粒pTT27的消除及16个蛋白酶基因敲除）；3) 表型驱动迭代优化（通过生长曲线、胞外蛋白酶活性及报告蛋白积累量评估）。

研究结果
Construction of promoter screening reporter vector
成功建立β-半乳糖苷酶缺陷菌株（HB27△TTP0042）作为启动子筛选宿主，从13个候选启动子中鉴定出P₀₉₈₄活性最强，其驱动报告基因表达量达野生型的13倍（P<0.05）。

Construction of HB27 plasmid-free strain
利用CRISPR缺陷株（HB27ΔIII-ABΔI-CΔCRF3，转化效率提升100倍）敲除pTT27质粒复制子repT，获得需腺苷钴胺素（AdoCbl）的营养缺陷型菌株HB27△pTT27，其基因组精简11%，但转化效率未受影响（2.13×10⁴ CFU/μg）。

Construction of protease-encoding loci knockout strains
通过单基因敲除验证16个预测非必需蛋白酶的功能：ΔTTC0264（ClpY/HsIU同源物）与ΔTTC1905（HhoB丝氨酸蛋白酶）显著降低胞外蛋白水解活性（水解圈直径1.64±0.50 mm）；ΔTTC0265（FtsH同源物）则导致生长迟滞。

Characterization of multiple protease-encoding loci knockout strains
基于表型分析迭代构建多敲除菌株，DSP9（10个蛋白酶缺失）在维持生长活力（OD₆₀₀≈3.8）的同时，胞内β-半乳糖苷酶积累量提升至野生型2倍（10,844 U/mg），且胞外蛋白酶活性降低至对照的1/3。

结论与意义
本研究首次实现嗜热栖热菌HB27的系统性工程改造：1) 鉴定出超强启动子P₀₉₈₄，填补高温表达工具空白；2) 构建的质粒游离株（HB27△pTT27）为抗生素无痕筛选提供新策略；3) 发现关键蛋白酶TTC0264/TTC1905，其敲除不仅降低胞外降解，还意外增强胞内蛋白稳定性（可能通过减轻错误折叠应激）。终极菌株DSP9整合基因组精简、高转化效率（CRISPR缺陷背景）与低蛋白酶活性三重优势，使热稳定蛋白产量显著提升。该成果为高温生物催化、酶制剂生产提供了颠覆性平台，其“胞外蛋白酶调控胞内蛋白稳定性”的新机制更为原核表达系统优化开辟新思路。