建立用于研究小鼠中人类免疫功能的反向遗传学系统

本研究开发了一种高效的人源化小鼠模型构建方法，通过电转Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合体（RNP）实现脐带血CD34+造血干/祖细胞（HSPCs）的基因编辑，成功构建了HLA-A2、TCF7、RAG2、CCR5和IFNAR基因敲除（KO）的人源化小鼠。该平台为研究人类免疫系统发育、HIV-1宿主互作及基因功能提供了强大的反向遗传学工具，填补了现有模型在翻译医学研究中的空白。

　　

摘要

反向遗传学方法在小鼠中的应用为解析基因功能及其在疾病中的异常提供了重要工具。然而，动物模型与人类生理的差异限制了研究结果的转化。人源化小鼠通过移植人类造血干/祖细胞（HSPCs）或基因替换，成为连接基础研究与临床应用的桥梁。本研究建立了一种高效的人脐带血CD34⁺细胞基因编辑方法，通过电转Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合体（RNP），实现了特定基因在人类免疫系统中的近完全敲除，为体内研究人类基因功能提供了新工具。

引言

基因修饰小鼠革命性地推动了基因功能和疾病机制的研究。然而，动物模型与人类生理的差异促使了人源化小鼠的发展。目前主要有两种人源化策略：基因替换或移植免疫缺陷小鼠人类HSPCs（CD34⁺细胞）。尽管CRISPR-Cas9技术已用于人类和小鼠HSPCs的基因敲除（KO），但编辑后细胞的免疫重建仍面临挑战。本研究旨在优化人脐带血CD34⁺细胞的基因编辑效率，并评估其在人源化小鼠模型中的应用。

结果

优化人脐带血CD34⁺细胞的基因敲除效率

通过电转Cas9/sgRNA RNP复合体，研究团队系统优化了脉冲程序、Cas9蛋白与sgRNA浓度等参数。以CD45为靶点，发现DZ-100程序结合10 μM Cas9和25 μM sgRNA可实现近100%的CD45敲除效率，同时保持约65%的细胞存活率。

优化编辑后CD34⁺细胞在免疫缺陷小鼠中的免疫重建

研究发现，移植3万以上电转CD34⁺细胞可显著提高人源化小鼠的嵌合率。短期体外培养（72小时）对细胞植入无显著影响，且电转未损害HSPCs的干性和多能性。在MISTRG-6-15小鼠中，电转组与未处理组的免疫重建水平相当，证实了方法的可靠性。

Cas9编辑后CD34⁺细胞的免疫重建

以HLA-A2为靶点，研究实现了移植后人源化小鼠中HLA-A2的完全缺失，且不影响免疫细胞发育。进一步通过TCF7和RAG2敲除，分别验证了T细胞发育阻滞和B/T细胞缺失的表型，成功模拟了已知免疫缺陷。

基因编辑人源化小鼠对HIV-1感染的响应

CCR5敲除小鼠对CCR5嗜性HIV_BaL感染完全抵抗，血浆病毒载量检测不到，CD4⁺ T细胞得以保留。IFNAR敲除则导致病毒载量升高10-100倍，证实了I型干扰素在控制HIV-1复制中的关键作用。

讨论

本研究建立的平台为研究人类免疫系统发育和病原体互作提供了强大工具。通过TCF7和RAG2敲除模型，可深入解析T细胞缺失对HIV-1潜伏库的影响。尽管无法研究造血必需基因，且缺乏细胞特异性敲除系统，该方法仍显著推进了人源化小鼠在转化医学中的应用。

材料与方法

研究使用NSG-SGM3和MISTRG-6-15小鼠，通过电转Cas9/sgRNA RNP编辑人脐带血CD34⁺细胞，移植后评估免疫重建和HIV-1感染表型。流式细胞术、深度测序和病毒载量检测为关键技术手段。