甜菜曲顶病毒互补链基因(C2/C4)及基因间区(LIR)调控植物同源重组频率的分子机制

本文开发了基于GFP荧光重建的可视化定量系统，首次揭示了甜菜曲顶病毒(BCTV)互补链基因C2/C4及大基因间区(LIR)的重复序列(iteron)和茎环结构(stem-loop)在双生病毒与卫星分子(CLCuMB-ΔβC1)同源重组(HR)中的核心作用。突变分析表明C2缺失使重组频率(HRF)降低至野生型的1/3，LIR结构破坏则完全阻断重组。该模型为优化CRISPR/Cas系统在植物中的同源定向修复(HDR)效率提供了新思路。

　　

摘要

同源重组是双生病毒科(geminiviruses)进化与致病的关键机制。本研究利用甜菜曲顶病毒(BCTV)复制子(BCTVRepl)与缺失βC1基因的棉花曲叶木尔坦卫星(CLCuMB)构建了新型可视化定量系统：将绿色荧光蛋白(GFP)拆分至病毒和卫星复制子中，通过荧光重建监测同源重组频率(HRF)。结果表明BCTV互补链基因C2和C4显著影响HRF——C2突变使重组细胞比例从30%降至10%，而LIR区的重复序列(iteron)和茎环结构(stem-loop)是重组发生的结构基础。

材料与方法

分子构建

通过吉布森组装构建CLCuMB复制子(CLCB)，保留卫星保守区(SCR)和富A区，移除βC1基因并引入多克隆位点(SpeI)。BCTV复制子(BCTVRepl)则删除毒粒基因(V1-V3)，保留互补链基因(C1-C4)及LIR区。将GFP C端(cGFP)插入BCTVRepl，N端(nGFP)插入CLCB或普通T-DNA载体，重叠区达442 bp。LIR序列通过PCR扩增插入nGFP两侧构建LnGFPL等变体。

功能验证

农杆菌浸润本氏烟叶片后：

1. qPCR检测：DpnI消化去除残留质粒后，定量显示CLCB在BCTVRepl存在时积累量提升3倍
2. 原生质体分析：共浸润BCTVRepl-cGFP与CLCB-nGFP时，27-34%细胞显示绿色荧光
3. 滚环扩增(RCA)：ScaI酶切证实LnGFPL与BCTVRepl共浸润产生1.8 kb新复制子

结果

基因功能分层调控

通过引入提前终止密码子构建系列突变体：

• C3突变：病毒DNA积累减少80%，HRF同步降低
• C4突变：HRF下降40%但病毒复制不受影响
• C2突变：HRF锐减至10%（病毒复制未显著变化）
• 三重突变(C2/C3/C4)：HRF与复制同步崩溃

LIR结构决定性作用

在T-DNA载体中引入LIR序列(LnGFP)使重组率升至5%，而双LIR构建体(LnGFPL)达19%。关键发现：

• 重复序列突变(mut-l)：破坏Rep结合位点使重组完全消失
• 茎环突变(mut-s/mut-d)：删除非核苷酸基序(TAATATT^AC)后重组阻断
• 纳米孔靶向测序(nCATS)：10,623条序列(0.41%)精准覆盖GFP重组区

讨论

机制创新性

1. C2新功能：首次揭示RNA沉默抑制子C2独立于复制调控HRF，可能通过激活宿主重组通路实现
2. LIR双功能模型：重复序列介导Rep结合，茎环提供重组热点，共同驱动RDR(重组依赖复制)
3. 卫星分子优势：CLCB自主复制能力使其HRF达T-DNA载体的7倍

应用前景

该模型突破传统重组分析局限：

• 为双生病毒科提供标准化HRF量化平台
• 鉴定C2/LIR可作为CRISPR/Cas系统中HDR效率增强靶点
• 解释自然界中73%卫星分子存在LIR嵌合现象（如recDNA-Ab17）

关键数据：图4显示CLCB-nGFP重组效率(34%)显著高于T-DNA载体(4%)；图6证实C2突变使荧光细胞比例从50%降至10%；图7揭示LIR结构破坏使重组归零。