黑曲霉高效异源蛋白表达平台的构建：基于糖化酶高产工业菌株的遗传改造

本研究针对黑曲霉(Aspergillus niger)异源蛋白表达中存在的内源蛋白分泌干扰、转录位点有限和分泌效率低等问题，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，在工业糖化酶高产菌株AnN1基础上构建了低背景底盘菌株AnN2。研究人员删除了13个TeGlaA基因拷贝并敲除主要胞外蛋白酶基因PepA，成功实现了葡萄糖氧化酶(AnGoxM)、热稳定果胶酶(MtPlyA)、细菌磷酸丙糖异构酶(TPI)和药用蛋白LZ-8的高效表达，产量达110.8-416.8 mg/L。该研究为丝状真菌表达系统的开发提供了实用框架。

　　

在生物技术领域，利用微生物细胞工厂生产重组蛋白已成为现代生物制造的核心技术。黑曲霉(Aspergillus niger)因其强大的蛋白分泌能力和"一般认为安全"(GRAS)认证地位，被广泛用于工业酶制剂生产。然而，异源蛋白表达在这个丝状真菌系统中仍面临多重挑战：高背景的内源蛋白分泌会干扰目标产物纯化；缺乏已知的高转录活性整合位点；分泌途径效率不足导致产量低下。这些问题严重制约了黑曲霉在复杂蛋白生产中的应用潜力。

天津科技大学和天津工业生物技术研究所的研究人员针对这些瓶颈问题，在工业糖化酶高产菌株AnN1的基础上，通过系统性的遗传改造，开发了一个高效、模块化的异源蛋白表达平台。相关研究成果发表在《Microbial Cell Factories》期刊上。

研究人员采用CRISPR/Cas9介导的多重基因组编辑技术，结合流式细胞分选技术，对工业菌株进行了精确改造。主要技术路线包括：(1)利用CRISPR/Cas9系统删除20拷贝TeGlaA基因中的13个拷贝；(2)敲除主要胞外蛋白酶基因PepA以降低蛋白降解；(3)在腾出的高表达位点整合四种代表性蛋白基因；(4)过表达COPI囊泡运输组分Cvc2优化分泌途径。所有实验菌株均通过诊断PCR和RT-qPCR验证，蛋白表达通过SDS-PAGE和Western blot分析，酶活测定采用标准比色法。

【构建和评估工程化黑曲霉宿主菌株AnN2】
研究团队首先对原始工业菌株AnN1的分泌组进行分析，确认其主要分泌蛋白为异源糖化酶TeGlaA、内源糖化酶AnGlaA和酸性α-淀粉酶AAmy。通过CRISPR/Cas9辅助的标记回收系统，成功将TeGlaA拷贝数从20个减少到7个，同时保留AnGlaA和AAmy基因座作为后续整合位点。改造后的底盘菌株AnN2胞外蛋白分泌量减少61%，糖化酶活性显著降低，为异源蛋白表达创造了"低噪声"环境。

【在工程化黑曲霉宿主菌株AnN2中表达同源葡萄糖氧化酶】
研究人员首先测试了黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶(AnGoxM)的表达。通过将AnGoxM基因整合到原TeGlaA和AnGlaA的高表达位点，获得了含12-13个拷贝的重组菌株。SDS-PAGE和Western blot分析显示，重组AnGoxM成功分泌，表观分子量约75kDa（理论值65kDa），提示存在糖基化修饰。酶活测定显示，48小时培养后活性达到1276-1328 U/mL，72小时进一步提升至1304-1458 U/mL，产量约364 mg/L，显著高于以往在酵母中的表达水平。

【在工程化底盘菌株AnN2中异源表达细菌TPI酶】
为验证平台对细菌蛋白的表达能力，研究团队选择了大肠杆菌来源的磷酸丙糖异构酶(TPI)。通过多拷贝整合策略，获得含11-12个tpi基因的重组菌株。SDS-PAGE显示清晰的28kDa条带，与理论分子量一致。酶活测定显示48小时达到1751-1907 U/mg的峰值活性，但72小时后活性下降约30%，表明该细菌蛋白在黑曲霉分泌系统中可能存在稳定性问题。

【在工程化黑曲霉菌株AnN2中表达药用真菌来源的免疫调节蛋白】
研究还成功表达了灵芝来源的免疫调节蛋白LZ-8。通过将10-13个拷贝的lz8基因整合到高表达位点，获得产量72.7-130.5 mg/L的重组菌株。14kDa的目标蛋白条带清晰可见，Ni-NTA一步纯化即可获得高纯度产品，展示了平台在药用蛋白生产中的应用潜力。

【通过过表达COPI组分Cvc2增强热稳定真菌果胶酶的表达】
为优化分泌效率，研究人员选择热稳定果胶酶MtPlyA作为模型蛋白，并过表达COPI囊泡运输组分Cvc2。结果显示，Cvc2过表达使MtPlyA产量提高18%，72小时酶活达到3202-3243 U/mL，证实调控分泌途径可有效提升异源蛋白产量。

该研究通过双层次优化策略，将理性的基因组工程与分泌途径的靶向增强相结合，建立了一个高效、稳定的黑曲霉异源蛋白表达平台。研究亮点在于：(1)利用工业菌株已有的强转录和分泌系统；(2)通过部分删除而非完全敲除糖化酶基因，平衡了低背景与宿主活力；(3)模块化的设计允许快速更换目标基因；(4)首次证明COPI组分Cvc2的过表达可提升丝状真菌的蛋白分泌效率。这些发现不仅为工业酶和生物药物的生产提供了新工具，也为理解丝状真菌的蛋白分泌机制提供了重要线索。该平台的建立将加速黑曲霉在生物制造领域的应用，特别是在需要复杂翻译后修饰的蛋白生产中展现出独特优势。