综述：可转移的CRISPR-Cas9方法在非模式昆虫中诱导基因组编辑：简明指南

这篇综述系统阐述了CRISPR-Cas9技术在非模式昆虫基因组编辑中的应用策略，重点介绍了sgRNA设计、Cas9递送方式（如ReMot/DiPa-CRISPR）、修复机制（NHEJ/HDR）及在害虫防控（如基因驱动gene drive、精准不育昆虫技术pgSIT）中的创新应用，为功能遗传学研究提供了跨物种可操作性框架。

　　

CRISPR-Cas9基因组编辑：非模式昆虫研究的新视野

细菌CRISPR(clustered regularly interspaced palindromic repeats)系统经改造后成为革命性的基因组编辑工具。其核心是Cas9核酸酶在sgRNA引导下靶向特定DNA序列，通过诱导双链断裂(DSB)激活细胞修复机制，实现基因敲除或精确修饰。这一技术突破了传统模式生物的限制，为昆虫功能遗传学开辟了新路径。

多种昆虫中已建立的CRISPR技术

最基础的应用是通过NHEJ修复产生移码突变（图1A）。例如，在家蟋蟀(Acheta domesticus)中敲除眼色素基因vermilion可产生可见表型标记。更复杂的HDR修复则能实现精准编辑，如果蝇(Drosophila)中利用短单链寡核苷酸(ssODN)引入单碱基突变（图1C），或蜜蜂(Apis mellifera)中通过长同源臂整合荧光标记基因（图1E）。

实验前的关键考量

成功编辑需满足两大前提：目标基因组序列已知（需验证品系特异性多态性）及胚胎显微注射可行性。对于卵壳坚硬或体内发育的物种，可采用母体血淋巴注射技术（如DiPa-CRISPR），通过卵黄蛋白受体介导递送RNP复合物。

向导RNA的设计艺术

sgRNA的20nt引导序列与PAM(NGG)相邻（图2A）。种子序列（近PAM端12nt）的错配容忍度低，而远端8nt可容忍多碱基差异（图2B）。推荐使用CRISPR Optimal Target Finder等工具预测脱靶风险，并通过T7核酸内切酶I检测或高通量测序验证编辑效率。

递送系统的创新突破

除常规质粒注射外，受体介导的卵巢转导(ReMot)技术可将Cas9-sgRNA复合物递送至德国小蠊(Blattella germanica)等难操作物种。在赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中，tRNA串联sgRNA系统使多重编辑效率提升3倍。

从基础研究到害虫防控

在疟蚊(Anopheles gambiae)中，针对doublesex基因的基因驱动可实现种群抑制（图4D）。而精准不育技术(pgSIT)通过敲除精子发生相关基因，已应用于苹果蠹蛾(Cydia pomonella)的田间防控。这些案例展示了CRISPR技术在解决公共卫生和农业问题中的巨大潜力。

未来挑战与展望

当前HDR效率在部分物种（如赤拟谷盗）仍低于1%，需优化同源臂长度（建议400-1000bp）和修复模板化学修饰。新兴的Cas12a系统因其T-rich PAM特性，可能为NHEJ介导的片段插入提供新选择。随着更多物种特异性启动子（如果蝇hsp70、家蟋蟀U6）的鉴定，CRISPR工具箱将进一步完善，推动非模式昆虫研究进入精准调控时代。