CRISPR-Cas9桥螺旋(BH)构象调控新机制：结构完整性与侧链相互作用协同调控DNA靶标识别

本研究针对CRISPR-Cas9基因编辑中的脱靶效应难题，通过位点定向自旋标记(SDSL)结合双电子-电子共振(DEER)光谱技术，解析了高度保守的桥螺旋(BH)在sgRNA结合过程中的动态构象变化。研究发现，野生型SpyCas9的BH在apo状态下呈螺旋-环-螺旋构象，sgRNA结合后转变为连续螺旋；而BH环区双脯氨酸突变体(SpyCas92Pro)虽能发生构象转换，却呈现多态性构象且稳定性降低，导致对PAM近端/远端错配DNA的切割活性显著下降。该工作首次在溶液态揭示BH构象动态与DNA识别精度的关联，为设计高特异性Cas9变体提供了新靶点。

　　

论文解读

研究背景与科学问题

基因编辑技术CRISPR-Cas9的革命性突破伴随着脱靶效应的重大挑战。Cas9蛋白通过桥螺旋(Bridge Helix, BH)连接核酸酶区(NUC lobe)和识别区(REC lobe)，其构象变化在DNA靶标识别中发挥核心作用。结构生物学研究表明，apo状态的Cas9中BH呈螺旋-环-螺旋构象（残基L64-T67形成环区），而sgRNA结合后转变为连续α螺旋。此前研究发现，将BH环区64位的亮氨酸和65位的赖氨酸突变为脯氨酸(SpyCas9^2Pro，即L64P-K65P)可显著提高DNA错配识别能力，但其分子机制尚不明确。

研究策略与技术方法

南加州大学与俄克拉荷马大学联合团队结合生物物理学与酶动力学方法展开研究：

1. 蛋白质工程：构建野生型(SpyCas9^WT)、双脯氨酸突变体(SpyCas9^2Pro)及双丙氨酸突变体(SpyCas9^2Ala)，并在BH的60/80位引入半胱氨酸用于自旋标记。
2. 溶液态构象解析：采用位点定向自旋标记(SDSL)与双电子-电子共振(DEER)光谱技术，测定apo状态及sgRNA结合状态下BH的60R1-80R1距离分布。
3. 功能验证：基于超螺旋质粒底物建立平行-序贯动力学模型，定量分析三种Cas9变体对完全匹配(MCH)、PAM近端错配(MM5)和远端错配(MM18)DNA的切割效率。

核心发现与结果解析

1. BH构象动态的突变体特异性差异

野生型(SpyCas9^WT)：

• DEER测量显示，apo状态BH呈宽分布(〈r〉=32?, σ=5.3?)，与螺旋-环-helix构象的灵活性一致；sgRNA结合后出现主峰(〈r〉=37?, σ=2.3?)，符合连续螺旋构象（图2）。

双脯氨酸突变体(SpyCas9^2Pro)：

• sgRNA结合后呈现双峰分布：组分1(42%, 〈r〉=37?, σ=4.5?)对应连续螺旋但柔性增加；组分2(58%, 〈r〉=40?, σ=1.4?)为刚性构象（图3B），表明脯氨酸取代破坏螺旋稳定性并诱导新构象。

双丙氨酸突变体(SpyCas9^2Ala)：

• 仅出现单一宽峰(〈r〉=34?, σ=4.0?)，比野生型缩短3?且柔性更高（图3C），提示丙氨酸维持螺旋倾向但削弱侧链相互作用。

2. 构象动态与功能失调的强关联

通过动力学模型定量切割参数（表1-3）：

• SpyCas9^2Pro：对MM5的TS通路线性化速率(k_2,RuvC)降至0，对MM18的NTS通路线性化速率(k_2,HNH)=0（表2-3），导致错配DNA切割完全阻滞。
• **SpyCas9<sup