优化多样化碱基编辑器用于高通量突变扫描研究的技术突破与机制解析

本研究针对多样化碱基编辑器(DCBEs)在哺乳动物基因组编辑中的效率与特性差异，系统评估了脱氨酶招募方式、递送方法等设计特征对编辑窗口、效率和突变谱的影响。通过构建200个sgRNA-靶点对文库，发现N端融合超活化AID**变体的DivA-BE编辑器效率较CRISPR-X提升4倍，并能产生互补链C>N(CompC>N)突变。研究为高通量突变扫描实验的编辑器选择提供了重要依据，相关成果发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

在基因组功能研究中，碱基编辑器已成为系统引入点突变的关键工具。然而，现有多样化碱基编辑器存在编辑效率不均、突变谱不可控等问题，特别是对于能产生C>T/A/G多种突变(C>N)的编辑器，其设计参数如何影响编辑特性尚不明确。这限制了其在蛋白质功能域扫描、疾病变异鉴定等高通量研究中的应用。

威斯康星大学麦迪逊分校和斯坦福大学的研究团队通过系统性比较不同架构的碱基编辑器，揭示了脱氨酶融合位置对编辑特性的决定性影响。研究发现将超活化AID**(含K10E/T82I/E156G/S66T/L104I/K160E突变)融合于dCas9蛋白N端形成的DivA-BE，其编辑效率较传统CRISPR-X系统提高4倍，且意外发现其能对与sgRNA互补的DNA链(靶链)产生CompC>N编辑。这种双向编辑能力为蛋白质变体库构建提供了新维度。

研究采用三大关键技术：1) 构建包含200个sgRNA-合成靶点对的慢病毒文库，通过独特分子标识符(UMI)区分真实突变与测序错误；2) 通过电穿孔(Transient)和慢病毒转导(Integrated)两种方式递送编辑器；3) 利用CRISPResso2分析工具量化等位基因编辑频率。

编辑效率与窗口特征
比较CRISPR-X(MS2-AID招募)、dCas9-AID(C端融合)和AID*-dCas9(N端融合)发现，N端融合编辑器效率最高(3.88倍于CRISPR-X)，且编辑窗口对称分布于PAM上游。DivA-BE(AID-dCas9)进一步将效率提升至CRISPR-X的4倍，而nDivA-BE(AID-nCas9)因切口酶活性导致编辑窗口向PAM偏移。

互补链编辑现象
DivA-BE和AID*-dCas9在靶链-27至-24bp窗口产生G>A/T/C(CompC>N)突变，其分布与C>N编辑窗口(-18至-15bp)存在偏移。结构分析显示dCas9 N端距靶链-24bp位点仅4.45nm，而C端距离达8.21nm，解释了C端融合编辑器CompC>N效率低的现象。n'Cas9(切割非靶链)可适度提高CompC>N比例，而rAPOBEC1编辑器几乎不产生CompC>N编辑。

脱氨酶特性比较
AID与rAPOBEC1编辑谱差异显著：DivA-BE3(AID-nCas9-UGI)的C>T纯度达90%，而BE3(rAPOBEC1)的C>G比例超28%。AID**在sgRNA靶区外(-20至0bp)更遵循WRC motif偏好，rAPOBEC1则强化TC motif倾向。

应用性能评估
nDivA-BE虽产生最多等位基因变异(35个/靶点)，但伴随较高indel频率(>10%)。DivA-BE3因其宽编辑窗口(>20bp)适合大区域扫描，而BE3窄窗口(-18至-13bp)更适合精确编辑。ABE7.10与DivA-BE序贯使用可协同产生A/T+C/G复合突变，拓展变异多样性。

该研究首次在多靶点尺度揭示了碱基编辑器设计参数与编辑特性的定量关系，建立的DivA-BE系统为功能基因组学研究提供了高效工具。发现CompC>N编辑现象为理解脱氨酶-底物互作机制提供了新视角，而编辑motif的上下文依赖性为预测模型开发奠定了基础。这些发现对精准医学中的基因治疗设计具有重要参考价值，相关编辑器已通过Addgene共享。