弓形虫表面抗原SAG1通过介导宿主细胞黏附增强IFNγ刺激环境下的生存适应性

本研究揭示了弓形虫（Toxoplasma gondii）关键表面抗原SAG1在干扰素γ（IFNγ）刺激环境中的新型防御机制。通过CRISPR/Cas9基因编辑构建Δsag1突变株，结合宿主细胞糖基化修饰模型（SLC35A1/EXTL3-DKO），首次证实SAG1通过识别宿主唾液酸（sialic acid）维持高亲和力黏附，抵抗IFNγ诱导的膜微环境改变，为靶向干预弓形虫免疫逃逸提供了新策略。

　　

弓形虫表面抗原SAG1介导IFNγ刺激环境下的生存优势与黏附机制

ABSTRACT
弓形虫（Toxoplasma gondii）作为专性细胞内寄生原虫，其表面抗原SAG1在多项CRISPR/Cas9筛选研究中被鉴定为IFNγ压力下的关键生存因子。研究团队通过构建SAG1敲除株（Δsag1），发现该突变株在IFNγ刺激的人包皮成纤维细胞（HFFs）中形成噬斑的面积缩减至野生型的34.8%，噬斑数量减少80.5%。深入机制研究表明，SAG1通过识别宿主细胞表面唾液酸维持高效黏附，这一作用在IFNγ重塑的膜微环境中尤为关键。

INTRODUCTION
弓形虫全球血清阳性率约25%，其致病性依赖于宿主细胞入侵与免疫逃逸双重能力。前期研究已明确干扰素γ（IFNγ）通过诱导IRGs、GBPs等效应分子破坏虫体，但入侵阶段的免疫抵抗机制尚不清晰。表面抗原家族（SAGs）与微线体蛋白（MICs）已知参与宿主识别，其中SAG1作为最丰富的表面蛋白，其免疫压力下的功能特异性尚未阐明。

RESULTS
SAG1敲除株的IFNγ敏感性特征
通过DHFR选择标记置换策略构建Δsag1突变株（图1A），噬斑实验显示：在未刺激HFFs中野生型与突变株无差异，而IFNγ处理使Δsag1噬斑面积（34.8±18%）显著小于野生型（68.9±22.8%）（图1B-C）。胆固醇代谢通路排除实验证实，25-羟基胆固醇（25HC）处理与去脂血清培养均未重现该表型（图2B-C），表明SAG1功能独立于胆固醇调控途径。

黏附缺陷的分子基础
寄生虫/空泡计数实验显示Δsag1在IFNγ刺激下的胞内寄生虫比例降低8%（图3B），总虫体数量减少56%（图3C）。使用唾液酸转运蛋白缺陷型（SLC35A1-KO）与硫酸乙酰肝素合成双敲除（SLC35A1/EXTL3-DKO）HT-29细胞系进行黏附实验，发现：野生型虫体在SLC35A1-KO细胞的黏附率降至55%，而Δsag1进一步降至43%；IFNγ刺激使Δsag1黏附率骤降至25%，显著低于野生型的稳定水平（图4）。这揭示SAG1通过高亲和力结合唾液酸克服IFNγ诱导的膜受体重构。

DISCUSSION
本研究建立了SAG1-唾液酸轴在免疫压力下的防御新范式。IFNγ通过下调宿主膜受体簇（如α2,3-唾液酸）破坏低亲和力黏附途径，而SAG1作为"分子锚定器"维持入侵效率。该发现为开发靶向SAG1的干预策略提供理论依据：①基于SAG1构象表位的疫苗可阻断垂直传播；②单克隆抗体可能增强IFNγ的协同杀虫效果。值得注意的是，新孢子虫（Neospora caninum）的NcSAG1同源蛋白具有相似功能，提示跨物种应用潜力。

MATERIALS AND METHODS
技术体系亮点包括：①利用UPRT位点定点互补实现SAG1回补表达验证；②建立15分钟快速黏附检测法；③结合糖基化缺陷细胞模型解析受体特异性。统计学处理采用双因素方差分析（two-way ANOVA），所有实验至少重复3次生物学重复。

这项研究不仅完善了弓形虫免疫逃逸的理论框架，更为治疗免疫缺陷患者合并弓形虫脑病等临床难题提供了新的分子靶点。未来研究可深入探索IFNγ调控宿主膜唾液酸分布的精确机制，以及SAG1与其他表面蛋白（如SABP1）的协同作用网络。