乳酸副干酪乳杆菌中Cas9非依赖性tracrRNA的细胞毒性机制研究

本研究揭示了CRISPR-Cas9系统中tracrRNA短亚型(tracr-S)在乳酸副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)中独立于Cas9的细胞毒性作用。研究人员通过构建系列质粒载体，发现tracr-S通过其anti-repeat和nexus区域与宿主RNA相互作用导致细胞毒性，并鉴定出转录调控因子Peg.728参与调控tracr-L表达。该研究为CRISPR-Cas9系统在非原生宿主中的应用提供了重要参考，发表于《microLife》。

　　

在基因组编辑领域，CRISPR-Cas9系统因其精准的DNA切割能力已成为革命性工具。然而，当这些系统被引入非原生宿主时，常常面临意想不到的挑战。其中，来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpyCas9)蛋白的细胞毒性已被广泛报道，但其他系统组分的潜在毒性却鲜为人知。这项由Helmholtz感染研究中心等机构完成的研究，首次揭示了CRISPR-Cas9系统中一个被忽视的"暗物质"——转激活CRISPR RNA(tracrRNA)的独立毒性作用。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1) 质粒构建与细菌转化，通过系列质粒设计解析毒性元件；2) Northern blot分析tracrRNA亚型表达；3) MS2亲和纯化偶联RNA测序(MAPS)鉴定tracrRNA相互作用靶标；4) 全基因组测序分析逃逸突变体；5) IntaRNA预测RNA-RNA相互作用。使用的乳酸菌样本包括L. paracasei B株及ATCC标准菌株。

研究结果部分：

1. The S. pyogenes Cas9 and tracrRNA are cytotoxic when expressed from a plasmid in Lacticaseibacillus paracasei
   研究发现当将含有SpyCas9和tracrRNA的质粒pCRISPR-Cas9转入L. paracasei时，转化效率显著降低。有趣的是，单独表达Cas9或tracrRNA仍会导致细胞毒性，但程度较轻，提示tracrRNA具有独立于Cas9的毒性作用。

1. tracrRNA cytotoxicity is caused by the short isoform of tracrRNA
   通过系列启动子突变实验，研究人员确定毒性源于tracrRNA的短亚型(tracr-S)。当破坏tracr-S启动子(P_tr-S)时，毒性消失，而保留tracr-S启动子但删除tracr-L启动子(P_tr-L)的构建体仍保持毒性。

1. Removal of the putative transcription regulator Peg.728 alleviates Cas9 and tracrRNA cytotoxicity
   通过对逃逸突变体的全基因组测序，发现一个转座子插入突变位于peg.728基因，该基因编码推测的转录调控因子。构建peg.728缺失株(Δpeg.728)后，tracrRNA相关毒性显著减轻。

1. tracr-L expression is repressed via peg.728 in L. paracasei
   Northern blot分析显示，在野生型菌株中仅检测到tracr-S表达，而在Δpeg.728突变株中可检测到tracr-L表达，表明Peg.728直接或间接抑制tracr-L表达。

1. The cytotoxicity of tracr-S is sequence-dependent, involving the anti-repeat and nexus regions
   通过构建嵌合tracrRNA发现，将tracr-S的anti-repeat和nexus区域替换为L. rhamnosus Cas9的对应序列可消除毒性，表明这些区域的序列特异性对毒性至关重要。

1. The tracrRNA interacts with cellular RNAs in L. paracasei
   通过MS2亲和纯化偶联RNA测序(MAPS)鉴定出多个与tracrRNA相互作用的宿主RNA，包括radC、peg.148等。IntaRNA预测显示这些相互作用主要涉及tracr-S的anti-repeat和nexus区域。

这项研究首次系统揭示了CRISPR-Cas9系统中tracrRNA的独立毒性作用机制。研究发现tracr-S通过其特定序列区域与宿主RNA相互作用导致细胞毒性，而宿主转录调控因子Peg.728通过抑制tracr-L表达参与这一过程。这些发现不仅解释了为何某些细菌中异源表达CRISPR-Cas9系统特别困难，也为优化基因编辑工具在非原生宿主中的应用提供了重要指导。特别值得注意的是，tracrRNA与宿主RNA的意外相互作用可能代表了CRISPR-Cas系统进化过程中的选择压力，这为理解CRISPR免疫系统的进化提供了新视角。该研究强调在应用CRISPR技术时，除关注Cas蛋白外，还需全面考虑所有系统组分的潜在影响。