荧光引导拉曼光谱技术结合支持向量机实现胶质瘤标志蛋白Cx43的跨细胞系检测

本研究针对肿瘤标志蛋白在原生细胞环境中难以获取特异性拉曼光谱的难题，开发了荧光引导拉曼光谱技术(FGRS)。研究人员通过筛选与532 nm拉曼系统兼容的蓝色荧光蛋白mTagBFP2，构建了连接蛋白43(Cx43)标记体系，利用支持向量机(SVM)建立了跨细胞系的分类模型，在胶质母细胞瘤(GBM)细胞中实现79%的检测准确率。该技术为肿瘤分子诊断提供了可定制的新工具。

　　

在精准医疗时代，胶质母细胞瘤(GBM)患者的预后仍停滞在15-16个月，这很大程度上归因于肿瘤异质性和治疗后耐药性。连接蛋白43(Cx43)作为肿瘤微管的关键组分，通过形成细胞间网络介导化疗抵抗，但其检测依赖耗时的人工染色或测序技术。传统拉曼光谱(RS)虽能快速获取生化指纹，却难以从复杂细胞环境中提取特定蛋白信号。这一技术瓶颈促使慕尼黑工业大学等机构的研究团队开发了创新性的荧光引导拉曼光谱(FGRS)技术。

研究团队采用三项关键技术：1) 532 nm激发光源下的荧光蛋白兼容性筛选，通过对比钠荧光素、eGFP和mTagBFP2的光谱干扰，确定mTagBFP2为最佳标记物；2) 构建Cx43-mTagBFP2融合蛋白表达系统，结合免疫荧光和Western blot验证表达定位；3) 建立基于支持向量机(SVM)的二元分类模型，分别采用全光谱(571波数)和特征峰(82波数)训练中/粗高斯核函数分类器。实验样本包括转染HEK293细胞和四种GBM细胞系(U87MG/T98G/Ln229/Ln18)。

mTagBFP2的光谱兼容性验证
通过系统评估三种荧光标记物发现，发射波长454 nm的mTagBFP2在532 nm激发下无光谱干扰，而eGFP和钠荧光素分别导致基线漂移和信号遮蔽。

光稳定性测试显示mTagBFP2在拉曼检测前后荧光强度保持稳定。

Cx43-mTagBFP2的结构与表达
I-TASSER预测显示融合蛋白保留Cx43的8个α-螺旋和mTagBFP2的β-桶状结构，二级结构置信度达6.22/9。免疫荧光证实其在细胞膜和内质网的生理性定位，Western blot检测到预期70 kDa条带。

特征拉曼位移鉴定
对比mTagBFP2-ER5对照，Cx43-mTagBFP2在600/1253/1401 cm^-1处峰消失，与α-螺旋含量增加预测一致。蛋白相关位移(752-760/1003/1657 cm^-1)差异最显著(d=1.98)，而核酸相关位移无统计学差异。

GBM细胞系光谱特征
U87MG(高Cx43表达)与融合蛋白光谱相似度最高(平均效应值0.64)，共享1250/1580 cm^-1处峰缺失特征。Western blot证实U87MG的Cx43表达量显著高于其他细胞系。

分类器性能评估
粗高斯SVM在全光谱模式下对HEK293测试集准确率达92.9%(AUC 0.99)，对GBM细胞系灵敏度达98.7%；特征峰模式则使特异性提升至90.8%。中高斯SVM在训练集表现更优(94.7%)但泛化能力较弱。

该研究开创性地将荧光定位与拉曼检测相结合，解决了特定蛋白原生环境检测的难题。通过mTagBFP2标记策略，首次获得Cx43的完整拉曼指纹，并建立可识别α-螺旋特征峰的跨细胞系分类模型。特别值得注意的是，特征峰筛选策略使模型在保持79%准确率的同时，显著提升了对临床GBM样本的识别特异性。这项技术为术中肿瘤边缘鉴定、耐药网络检测提供了新思路，其模块化设计也适用于其他肿瘤标志物的研究。未来通过扩大样本量和优化算法参数，有望进一步提升诊断效能，推动拉曼光谱在精准医疗中的应用。