利用CRISPR基因编辑技术重编程内源基因实现CAR-T细胞肿瘤靶向递送细胞因子的突破性研究

本研究针对CAR-T细胞治疗实体瘤面临的免疫抑制和抗原异质性难题，创新性地开发了基于CRISPR基因编辑的内源基因重编程策略。研究人员通过筛选肿瘤特异性表达的NR4A2和RGS16启动子，成功实现了IL-12和IL-2等细胞因子在肿瘤部位的精准递送。该研究在小鼠同种异体和异种移植模型中显著增强了抗肿瘤效果，同时改善了CAR-T细胞的多功能性并激活内源性抗肿瘤免疫，且展现出良好的安全性特征。这一突破为下一代"装甲型"CAR-T细胞的开发提供了新思路。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CAR-T细胞疗法虽然在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成效，但在实体瘤治疗中仍面临三大挑战：免疫抑制性肿瘤微环境(TME)、肿瘤抗原异质性以及CAR-T细胞向肿瘤部位的归巢障碍。其中，通过工程化改造使CAR-T细胞分泌促炎细胞因子的"装甲型"策略虽展现出潜力，却因细胞因子的全身性表达导致严重毒性。此前临床研究中，基于NFAT启动子的IL-12装甲CAR-T细胞疗法(NCT01236573)就因严重毒性而提前终止，凸显了开发更精准调控系统的迫切需求。

为解决这一关键问题，来自Peter MacCallum癌症中心等机构的研究团队在《Nature》发表了创新性研究成果。研究人员采用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(HDR)技术，将细胞因子基因精准插入内源性基因位点，利用内源基因的天然调控机制实现肿瘤部位特异性表达。通过对27个候选基因的系统筛选，最终确定NR4A2和RGS16启动子能最佳平衡表达强度和肿瘤特异性。

研究团队首先建立了高效的CRISPR编辑体系，在PD-1基因位点成功插入报告基因GFP，验证了技术可行性。随后通过RNA测序(RNA-seq)分析肿瘤浸润和脾脏CAR-T细胞的转录组差异，发现NR4A2和RGS16在肿瘤部位特异性高表达。机制研究表明，NR4A2/IL-12 CAR-T细胞不仅能增强自身效应功能，还能通过"表位扩散"激活内源性抗肿瘤免疫，这在MC38-hHer2等难治性肿瘤模型中尤为显著。重要的是，与NFAT系统相比，NR4A2启动子驱动的IL-12表达在脾脏等外周组织几乎检测不到，完全避免了毒性反应。

在临床转化方面，研究证实该策略可成功应用于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤患者的T细胞。通过"一步法"制造流程，可同时实现CAR基因在TRAC位点的插入和细胞因子基因在NR4A2/RGS16位点的整合，大大简化了临床生产流程。

这项研究的突破性意义在于：首次利用内源基因的完整调控网络（包括启动子和远端调控元件）实现了CAR-T细胞分泌蛋白的精准时空控制；建立了NR4A2和RGS16两大新型调控平台，分别适用于高毒性因子(如IL-12)和温和因子(如IL-2)的表达；为克服实体瘤治疗障碍提供了多功能解决方案。该技术路线还可拓展至CAR巨噬细胞、CAR-NK细胞等其他免疫细胞疗法，以及自身免疫病治疗领域，展现出广阔的临床应用前景。

研究结果部分的主要发现包括：

Generation of CRISPR-edited armoured Tcells

通过优化电转条件和AAV6递送系统，在PD-1位点实现高达50%的编辑效率。PD-1/TNF OT-I细胞显示出增强的肿瘤控制能力和旁观者杀伤效应，且未观察到明显毒性。

Identification of optimal target genes

RNA-seq分析鉴定出27个肿瘤高表达基因，其中NR4A2和RGS16表现出最佳的肿瘤特异性表达模式。在人类CAR-T细胞中，NR4A2/GFP在脾脏的表达率<10%，而肿瘤部位表达强度显著高于PD-1启动子。

NR4A2/IL-12Tcells are potent and safe

Nr4a2启动子驱动的IL-12表达在小鼠模型中完全避免了毒性反应，即使治疗晚期大肿瘤也能显著延长生存期。相比之下，NFAT-IL-12 CAR-T细胞导致小鼠迅速出现弓背、活动减少等毒性症状。

Activation of host antitumour immunity

NR4A2/IL-12 CAR-T细胞治疗可增加肿瘤浸润CD8⁺ T细胞数量，并促进针对p15E等肿瘤新抗原的特异性T细胞应答。TCR测序显示治疗组出现寡克隆扩增，证实了表位扩散现象。

Efficacy of human armoured CART cells

在OVCAR-3人源肿瘤模型中，NR4A2/IL-12 CAR-T细胞展现出显著增强的抗肿瘤效果，治愈小鼠对二次攻击产生免疫记忆。患者来源的CAR-T细胞也成功实现了肿瘤特异性GFP表达。

Clinical applicability of knock-in approach

单细胞RNA-seq分析证实NR4A2和RGS16在多种癌症类型的肿瘤浸润T细胞中高表达。该技术对低抗原密度和低亲和力TCR均保持敏感性，具有广泛的适用性。

这项研究开创性地将内源基因调控机制与CRISPR编辑技术相结合，解决了装甲CAR-T细胞治疗的关键安全性问题。相比合成启动子系统，内源启动子能更精确地模拟天然基因的表达调控，包含远端增强子等顺式调控元件，可实现对转基因表达的精细调控。这一策略不仅为IL-12等高效但高毒性的细胞因子提供了安全递送平台，其模块化设计还允许根据治疗需求选择不同的启动子-细胞因子组合，为个性化肿瘤免疫治疗开辟了新途径。