大麻毛状根高效转化新策略：基于母株的两步法CRISPR/Cas系统代谢工程研究

为解决大麻毛状根(HR)转化效率低、耗时长的问题，加拿大拉瓦尔大学团队开发了基于母株的两步法ex vitro转化技术。研究通过优化农杆菌(A. rhizogenes)介导的RUBY报告系统，实现90%转化效率(TE)，较传统方法缩短9-29天。该成果为CRISPR/Cas系统在大麻次级代谢物生产中的应用提供了高效平台。

　　

在药用植物研究领域，大麻(Cannabis sativa L.)因其独特的次级代谢产物备受关注。这种古老植物含有超过120种大麻素(cannabinoids)，其中Δ⁹-四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)分别具有精神活性和医疗价值。然而长期以来，法律限制导致其遗传研究严重滞后。随着全球合法化进程，如何高效生产这些高价值代谢物成为科研与产业界的共同挑战。传统依赖雌株花器提取的方法存在周期长、成本高等缺陷，而基于毛状根(hairy root, HR)培养的生物技术路线虽具潜力，却受限于转化效率低、操作复杂等问题。

针对这一技术瓶颈，加拿大拉瓦尔大学的研究团队在《BMC Biotechnology》发表创新成果。研究人员开发出革命性的"母株两步法"转化技术，将大麻HR转化效率提升至90%，同时将生产周期大幅缩短。这项研究不仅为大麻代谢工程提供了高效工具，更开创性地将CRISPR/Cas基因编辑系统与HR培养技术结合，为定向改造大麻素合成通路奠定基础。

研究采用三种技术路线对比：传统组织培养(in vitro)法、一步ex vitro法（使用岩棉/Jiffy pellet培养基）和创新性两步ex vitro法（直接接种母株）。关键技术包括：1）利用RUBY报告基因实现可视化筛选（无需化学处理）；2）优化农杆菌(A. rhizogenes)A4菌株转化条件；3）建立母株直接接种的创伤-感染两步法。实验采用三种大麻品种（AJ-441、AJ-341、AA-461）验证方法普适性。

【In vitro hairy root transformation】
传统组织培养法表现最差，转化效率仅33%，且需35天才能获得足量转基因HR。该方法易受污染影响，凸显无菌操作的高难度。

【Ex vitro one-step hairy root transformation】
使用岩棉/Jiffy pellet培养基的一步法显示菌株特异性：R1000和A4菌株实现100%HR诱导，但转化效率(TE)分别为56.25%和50%。K599菌株表现最差（43.75%HR诱导，0%TE），表明菌株选择对成功率至关重要。

【Ex vitro two-step-mother plant】
创新性两步法表现卓越：14天即出现HR，22天形成大量红色转基因HR（RUBY表达）。该方法实现100%HR诱导和90%TE，总耗时仅24天，较其他方法快9-29天。母株的成熟生理状态保障了稳定性，完全避免污染风险。

研究结论部分强调，这项技术突破具有三重意义：首先，母株两步法创造了目前大麻HR转化的最高效率记录（90%TE）；其次，RUBY报告系统实现了非破坏性实时监测；最重要的是，该方法与CRISPR/Cas系统的兼容性，为未来大麻素合成通路的精准编辑提供可能。讨论部分指出，虽然AJ-441品种表现优异，但需在不同化学型大麻中验证普适性。作者建议后续研究可探索自动化接种设备，以适配工业化生产需求。

这项研究标志着大麻生物技术进入新阶段。通过将农杆菌转化、报告基因筛选和母株栽培技术巧妙结合，团队开发出迄今最快、最可靠的HR生产系统。随着药用大麻需求激增，该技术有望成为标准化生产高价值大麻素的"绿色工厂"，为个性化药物开发提供全新平台。