DNA聚合酶θ介导的末端连接中错配微同源序列的选择机制及其在癌症基因组突变分析中的意义

研究人员针对DNA双链断裂修复中Polθ（DNA polymerase theta）介导的末端连接（TMEJ）的微同源（MH）选择机制展开研究，通过高通量测序和体外实验发现Polθ偏好选择含错配的内部微同源序列，且匹配位点集中于3'端6个碱基内。该研究重新定义了微同源的概念，为癌症基因组突变特征分析提供了新视角，成果发表于《Nature Communications》。

　　

在基因组维护的复杂战场上，DNA双链断裂（DSB）是最危险的损伤类型之一。若修复不当，可能导致染色体灾难性重排甚至细胞死亡。传统修复途径如同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）如同精密的手术团队，但某些情况下——比如HR缺陷的癌细胞——细胞会启用一个"急救员"：DNA聚合酶θ（Polθ）介导的末端连接（TMEJ）。这种修复方式依赖短至2-6个碱基的微同源序列（MH）作为"分子胶水"粘合断裂末端。然而长久以来，科学家们困惑于两个谜团：为何某些明显缺乏连续匹配碱基的断裂仍能被Polθ修复？这个"急救员"选择"胶水"时究竟遵循什么规则？

为揭开这些谜题，美国MD安德森癌症中心Richard D. Wood团队联合多机构研究人员，在《Nature Communications》发表重要成果。研究通过构建含随机3'端的寡核苷酸文库，结合高通量测序技术，首次系统描绘了Polθ选择微同源序列的分子图谱。

研究主要采用四大关键技术：1）构建含荧光标记的配对寡核苷酸文库模拟DSB末端；2）使用纯化人源PolθΔcen（含解旋酶样结构域和聚合酶结构域的截短体）进行体外TMEJ反应；3）通过限制性酶切和Sanger测序验证连接产物；4）开发生物信息学流程分析高通量测序数据，定量评估微同源选择偏好。

Polθ延伸匹配与错配寡核苷酸的能力
实验显示PolθΔcen能延伸含完全匹配或3'端错配的寡核苷酸。如图1所示，无论底部链3'端是否含3个错配碱基（Oligo 7 vs Oligo 62），Polθ均可介导末端连接。BamHI酶切验证证实两条链均被完整延伸，测序显示7条序列中3条源自顶部链延伸，4条源自底部链延伸，包括1例单核苷酸缺失的环出 priming（loopout priming）事件。

内部微同源序列的优先选择
当提供4 bp核心微同源时，Polθ更倾向选择内部更长的错配微同源。如图2所示，在含2个3'端错配的Oligo 2N2M中，16条测序序列仅5条使用预设的4 bp MH，其余选择含两个错配的9 bp内部MH（如序列CXXXAA）。通过3'磷酸化（Oligo 10）或尿嘧啶替换（Oligo 9）阻断底部链延伸的实验证实，单链延伸足以启动TMEJ。

错配微同源的优选机制
高通量测序揭示约80%的微同源选择发生在3'端15个碱基内（图5d）。关键发现是：1）P1位置（最3'端碱基）匹配最关键（选择概率0.93）；2）P2-P5匹配虽非必需但显著提升选择概率；3）匹配碱基无需连续（图6）。例如Library 10中，含2-5个非连续匹配的错配MH占主导，完全匹配的6 bp MH仅占少数。

生物学意义与重新定义微同源
该研究颠覆了传统微同源必须连续匹配的认知。如图8所示，重新分析K562细胞CRISPR-Cas9诱导的DSB修复数据发现，14个原归类为"0-4 bp MH"的Polθ依赖性缺失，实际可能源自更长的错配MH。例如靶位点3的两个10 bp缺失（原判为1bp和2bp MH），实为同一6 bp错配MH（CXXXAA）经不同修复路径产生。

这些发现对癌症研究具有双重意义：首先解释了HR缺陷癌细胞依赖Polθ的分子基础——错配MH的广泛存在大幅提升了修复机会；其次为癌症基因组突变特征分析提供新框架，某些原归类为"无MH"的缺失可能实际使用了错配MH。如图9所示，一个含P3/P4匹配的6 bp错配MH，经复制或错配修复后可能仅显示为2 bp MH特征。

该研究不仅完善了DNA修复理论体系，更为开发靶向Polθ的癌症治疗策略提供了新思路。通过揭示Polθ独特的"容错"机制，科学家们现在能更准确地解读癌症基因组中的突变签名，为个性化治疗方案的制定增添重要砝码。