工程化酿酒酵母实现甘油、木糖、乙酸与葡萄糖共发酵生产乙醇的代谢突破

本研究针对酿酒酵母(S. cerevisiae)碳源利用范围受限的瓶颈，通过CRISPR基因组编辑技术构建了能同时利用甘油、木糖、乙酸和葡萄糖的工程菌株SK2-5。通过引入Pichia stipitis木糖代谢途径(PsXR/PsXDH)、Salmonella enterica乙酰化乙醛脱氢酶(SeEutE)及优化JEN1/ACS1L707P表达，实现了95%理论乙醇转化率，为生物炼制提供了多底物共利用的代谢框架。

　　

全球生物乙醇年产量已超1100亿升，但传统酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)仅能发酵葡萄糖等有限碳源，制约了产业扩张。随着生物柴油产业兴起，其副产物甘油成为兼具预处理溶剂与发酵底物潜力的新选择。然而，天然酵母无法高效利用甘油、木糖(xylose)和乙酸(acetic acid)，而现有工程菌株尚未实现四碳源共发酵。这一瓶颈阻碍了生物炼制过程的整合优化，亟需构建更灵活的微生物催化平台。

日本京都大学可持续人居环境研究所的Sadat Mohamed Rezk Khattab团队在《Bioresource Technology》发表研究，通过多靶点代谢改造，首次实现了酿酒酵母对甘油、木糖、乙酸和葡萄糖的同步共发酵。研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在前期开发的甘油-葡萄糖共利用菌株SK-FGG4基础上，系统性重构碳代谢网络：用Pichia stipitis的木糖还原酶(PsXR)和木糖醇脱氢酶(PsXDH)替代内源ALD6基因，并共表达木酮糖激酶；以Salmonella enterica的乙酰化乙醛脱氢酶(SeEutE)置换线粒体NDE1/NDE2；同时过表达单羧酸转运蛋白JEN1和突变型乙酰-CoA合成酶(ACS1_L707P)。通过微氧发酵实验证实，改造后的SK2-5菌株对混合底物的乙醇转化效率超过95%理论值。

主要技术方法
研究采用CRISPR-Cas9进行基因组编辑，构建PsXR-PsXDH-XK木糖代谢模块和SeEutE乙酸利用模块；通过适应性实验室进化(ALE)优化菌株性能；使用HPLC监测代谢物动态；采用α-折叠(AlphaFold2)进行蛋白结构预测验证。

研究结果

Formulation of cultivation and fermentation media
开发了含遗传霉素(G418)的YPD_G418选择培养基，支持CRISPR编辑菌株的筛选与培养。

Tracking aerobic fermentation of glycerol-xylose-acetic acid with glucose
微氧条件下，SK2-5展现出四碳源协同代谢特征：木糖与葡萄糖的共转运通过JEN1增强，乙酸经SeEutE转化为乙醇时同步解决了XDH途径的NADH过剩问题，甘油代谢则通过前期改造的GLP1/ADH2模块维持氧化还原平衡。

Conclusion
该研究突破了酿酒酵母碳源利用的天然限制，首次实现单一菌株对四种工业相关碳源的高效共发酵。这种"代谢混搭"策略不仅提高了生物质转化效率，还为耦合生物柴油-乙醇联产、酸催化甘油解等新型生物炼制工艺提供了通用底盘细胞。

讨论与意义
研究通过模块化工程策略，将细菌(SeEutE)、真菌(PsXR/PsXDH)和酵母内源途径有机整合，解决了传统木糖代谢的氧化还原失衡(XR/XDH途径需NADPH/NAD⁺交替)与乙酸毒性的协同难题。特别值得注意的是，ACS1_L707P突变体通过降低乙酰-CoA合成酶对AMP的敏感性，显著提升了乙酸同化速率。这种多碳源共利用能力可大幅降低原料分离成本，使甘油预处理后的木质纤维素全组分(包括水解产生的乙酸和木糖)得以高效转化，推动"零废弃"生物炼制模式的发展。