综述：基于CRISPR-Cas筛选的功能基因组学方法在药物靶点发现中的应用——扰动组学（Perturbomics）

这篇综述系统阐述了CRISPR-Cas筛选技术驱动的扰动组学（Perturbomics）在功能基因组学和药物靶点发现中的突破性进展。文章重点介绍了CRISPR-Cas9基因编辑技术（包括CRISPRi/a、碱基编辑等变体）如何通过单细胞转录组分析（scRNA-seq）、类器官模型等技术，揭示癌症、心血管疾病和神经退行性疾病的治疗靶点（如WRN、PKMYT1、APLNR等），并探讨了人工智能（AI）在预测基因扰动表型中的潜力。

　　

扰动组学：CRISPR-Cas筛选在功能基因组学和药物靶点发现中的革命性应用

引言

尽管人类基因组计划完成已逾二十年，约80%的人类基因功能仍未被充分解析。功能基因组学通过系统性扰动基因功能并分析表型变化（即扰动组学），为揭示基因在疾病中的作用提供了新范式。CRISPR-Cas技术的出现彻底改变了这一领域，其高精度、高通量的特性使其成为鉴定癌症、心血管疾病和神经退行性疾病治疗靶点的核心工具。

CRISPR筛选的基础设计

CRISPR-Cas9系统由Cas9核酸酶和引导RNA（gRNA）组成，通过诱导DNA双链断裂（DSB）并引入插入/缺失突变（InDel）实现基因敲除。如图1所示，gRNA文库通过慢病毒递送至Cas9表达的细胞中，经药物筛选或流式分选（FACS）后，通过测序分析sgRNA丰度变化，从而关联基因与表型。

技术进展

1. 超越基因敲除的筛选策略
传统Cas9敲除存在局限性，如无法靶向非编码RNA（lncRNA）和DNA断裂毒性。通过改造dCas9（催化失活Cas9）融合KRAB转录抑制域（CRISPRi）或VP64激活域（CRISPRa），可实现基因沉默或激活（图2a）。碱基编辑器和Prime编辑器进一步支持单核苷酸变体（SNV）的功能研究（图2b），例如通过PEER-seq技术解析意义未明变异（VUS）的功能。

2. 多样化表型读数的整合
传统筛选依赖细胞存活率等简单指标，而单细胞CRISPR筛选（如Perturb-seq、CROP-seq）结合转录组分析，可解析基因扰动后的全基因组表达变化。例如，在树突状细胞中发现转录因子（TF）调控模块（如Stat1/2的M1模块），或在T细胞中揭示LCK/ZAP70缺失导致T细胞受体（TCR）信号抑制。

癌症治疗靶点的发现

1. 靶向“不可成药”肿瘤的合成致死策略
CRISPR筛选揭示了合成致死相互作用，如WRN解旋酶在微卫星不稳定（MSI-H）结直肠癌中的必要性，或PKMYT1激酶抑制对CCNE1扩增肿瘤的特异性杀伤（图3a）。组合筛选（如双sgRNA文库）还发现了FAM50A-FAM50B基因对在黑色素瘤中的合成致死效应。

2. 癌症免疫治疗新靶点
通过肿瘤-T细胞共培养或同种移植模型，筛选出调控免疫逃逸的关键基因，如PTPN2（JAK-STAT通路负调控因子）、ADAR1（双链RNA感应抑制因子）等（图4a-b）。在CAR-T细胞筛选中，DHX37通过NF-κB信号增强T细胞活性，而PRODH2通过脯氨酸代谢重编程提升疗效。

3. 代谢脆弱性的挖掘
肿瘤代谢重编程（如氧化磷酸化OXPHOS、铁死亡）成为治疗突破口。例如，抑制多胺合成酶AMD1可逆转BRAF抑制剂耐药性；KEAP1缺失与ATM抑制协同诱导铁死亡。类器官模型进一步验证了BAZ2等染色质重塑因子在肝再生中的作用。

展望：AI与复杂模型驱动的未来

人工智能（如GEARS模型）正加速基因扰动表型的预测，而类器官和体内筛选技术（如AAV递送）将推动靶点发现在生理相关模型中的应用。扰动组学与单细胞多组学的结合，将为疾病机制和精准治疗开辟新路径。