拟南芥中缺失过氧化物酶体蛋白PEX8的鉴定与功能表征揭示真核生物蛋白转运机制的保守性

本研究针对真菌特有蛋白Pex8在植物中的同源基因缺失问题，通过结构同源预测发现拟南芥At1g73970蛋白具有类似酵母Pex8的HEAT重复结构和双PTS信号。研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑和人工microRNA技术证实PEX8对过氧化物酶体腔蛋白导入(PTS1/PTS2途径)和胚胎发育至关重要，荧光标记显示PEX8定位于过氧化物酶体膜相关斑点。该研究首次在植物中发现PEX8同源基因，揭示了真核生物过氧化物酶体蛋白转运机器的深度保守性，为研究"酵母特有"过氧化物酶体蛋白在高等生物中的存在提供了新思路。

　　

过氧化物酶体是真核细胞中负责脂肪酸β-氧化、活性氧代谢和植物激素合成等重要代谢反应的关键细胞器。这些动态的细胞器需要从细胞质导入完全折叠的蛋白质，这一过程依赖于过氧化物酶体蛋白(PEX proteins)的协同作用。尽管大多数PEX蛋白在真菌、植物和动物中高度保守，但长期以来Pex8被认为是真菌特有的过氧化物酶体基质蛋白，在酵母中已被证明对腔蛋白导入至关重要，然而在其他生物界中始终未被发现。这一认知空白使得科学家们对真核生物过氧化物酶体蛋白转运机制的完整性和保守性产生了疑问。

美国莱斯大学Gabrielle C. Buck等研究人员在《The Plant Cell》发表的研究打破了这一认知壁垒。面对传统BLAST搜索无法识别植物PEX8同源基因的困境，研究团队另辟蹊径，采用HHpred结构同源预测软件，成功鉴定出拟南芥At1g73970蛋白具有与酵母Pex8相似的三维结构。这个被命名为At PEX8的蛋白与Sc Pex8仅有11%的序列相似性，但两者都含有预测的HEAT重复结构和两个过氧化物酶体靶向信号(PTS1和PTS2)，这种结构相似性暗示了潜在的功能保守性。

为验证这一发现，研究人员运用了多种关键技术：通过CRISPR/Cas9构建PEX8靶向突变体，利用人工microRNA(amiRNA)技术构建部分功能缺失株系，采用免疫印迹分析蛋白加工效率，结合荧光标记和共聚焦显微镜观察亚细胞定位，并通过生理表型分析评估过氧化物酶体功能。这些方法相互补充，为研究结论提供了多层次证据。

研究结果部分首先揭示了PEX8在拟南芥中的必需性。通过分析pex8插入突变体(pex8-1)和CRISPR诱导的移码突变体(pex8-04)，发现纯合突变导致胚胎致死和配子体发育缺陷，这与许多过氧化物酶体生物发生基因的突变表型一致。RNA-seq数据显示PEX8在所有组织中均有低水平表达，类似于其他过氧化物酶体蛋白基因的表达模式。

在"pex8-amiR株系表现出腔蛋白导入缺陷和过氧化物酶体功能障碍"部分，研究团队构建了靶向PEX8的人工microRNA株系。这些株系表现出典型的过氧化物酶体缺陷表型：对吲哚-3-丁酸(IBA)的敏感性降低、蔗糖依赖性增强、三酰甘油(TAG)和油质蛋白(OLE1)降解延迟。免疫印迹分析显示PTS2蛋白(PMDH和硫解酶)的加工效率降低，同时荧光标记的PTS1报告蛋白(mRuby3-PTS1)出现细胞质泄漏，这些结果强有力地证明了PEX8在PTS1和PTS2两种蛋白导入途径中的关键作用。

最引人注目的发现在于"PEX8定位于过氧化物酶体膜相关斑点"。研究人员构建了N端融合mTagBFP2-HA的PEX8报告蛋白，发现其并非均匀分布于过氧化物酶体腔，而是形成与膜相关的斑点结构。即使删除PTS1或PTS2信号，这种斑点定位依然存在，而双缺失突变体(pex8ΔPTS1ΔPTS2)的定位明显减弱，表明PEX8可能通过多种方式进入过氧化物酶体。

在讨论部分，研究强调了几个重要观点：首先，这是首次在植物中发现PEX8同源基因，扩展了对过氧化物酶体蛋白转运机器保守性的认识；其次，研究展示了结构生物学在识别快速进化蛋白同源物中的独特价值；再者，PEX8独特的斑点定位暗示了过氧化物酶体腔中可能存在新的功能亚区室。特别值得注意的是，AlphaFold3预测显示At PEX5可能通过其无序N端区域与PEX8表面多个疏水口袋相互作用，这为理解PEX8的导入机制提供了新线索。

这项研究不仅解决了长期存在的Pex8同源基因缺失问题，更重要的是提出了"酵母特有"过氧化物酶体蛋白可能广泛存在于其他真核生物中的新假说。由于过氧化物酶体功能障碍与多种人类疾病相关，这些发现将为研究过氧化物酶体相关疾病的分子机制提供新的视角。此外，研究中建立的技术体系和方法策略，如基于结构同源的基因挖掘和多重定位报告系统的应用，为今后研究其他难以识别的保守蛋白提供了宝贵范例。