单分子高通量平台揭示DNA超螺旋对CRISPR-Cas9和错配修复蛋白MutS的调控机制

本研究通过开发高效的质粒DNA位点特异性标记技术，构建了能模拟生理水平正/负超螺旋的DNA分子工具，利用单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术首次系统揭示了DNA超螺旋状态对CRISPR-Cas9脱靶效应和错配修复蛋白MutS结合动力学的影响。研究发现负超螺旋会加剧Cas9在错配条件下的DNA解旋，而正/负超螺旋均可增强MutS与错配碱基的结合稳定性。该工作为理解表观遗传调控提供了新视角，发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

DNA作为遗传信息的载体，其空间构象的动态变化深刻影响着生命活动。在细胞内，DNA超螺旋（supercoiling）这种拓扑学特征如同被拧紧或放松的弹簧，通过改变双螺旋的缠绕程度调控基因表达、DNA复制和修复等关键过程。然而，这种纳米尺度的结构变化如何精确影响蛋白质与DNA的相互作用，一直是困扰科学界的难题。传统凝胶电泳等技术无法捕捉实时动态，而磁镊、光镊等单分子技术又存在通量低、操作复杂等局限。

为突破这些技术瓶颈，由Taekjip Ha领衔的研究团队开发了一种革命性的研究平台。他们巧妙地将酶介导的位点特异性标记技术与单分子荧光成像相结合，首次实现了在生理相关超螺旋水平下，对蛋白质-DNA互作的高通量实时观测。这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究，不仅揭示了DNA超螺旋对基因编辑工具CRISPR-Cas9特异性的调控机制，还阐明了错配修复核心蛋白MutS的识别新原理。

关键技术包括：1）利用BbvCI切口酶在pUC19质粒特定位点引入荧光标记和生物素；2）通过gyrase和reverse gyrase分别产生生理水平的负超螺旋（σ=-0.07）和正超螺旋（σ=+0.03）；3）采用单分子全内反射荧光显微镜（smTIRF）进行FRET实时监测；4）运用隐马尔可夫模型分析蛋白质动态。

CRISPR-Cas9：负超螺旋加剧脱靶效应
通过设计含错配的向导RNA（gRNA），研究人员发现负超螺旋会使dCas9-gRNA复合体在PAM近端单碱基错配时的解旋速率提高3倍。当存在连续三个PAM远端错配时，负超螺旋质粒的解旋比例（f_unwound=0.77）显著高于正超螺旋（0.45）。动力学分析显示负超螺旋同时加速解旋（k₁↑）并抑制复旋（k_-1↓），这种"双重调控"效应从能量角度解释了基因编辑脱靶的分子基础。

MutS：超螺旋增强错配识别
在错配修复研究中，团队观察到超螺旋显著延长MutS与GT错配的结合时间：负超螺旋使解离速率k_off降低至松弛DNA的1/2.7（0.075 vs 0.204 s^-1）。有趣的是，虽然超螺旋稳定了初始结合态，但ATP诱导的滑动夹（sliding clamp）形成速率k₂不受影响。这表明超螺旋主要通过促进DNA弯曲（bending）来增强错配识别，而不影响后续修复信号传递。

这项研究建立了首个能精确控制超螺旋状态的单分子分析平台，其创新性体现在：1）通过双切口酶策略实现环状DNA的多位点标记；2）将传统生化分析与单分子技术完美结合；3）揭示超螺旋作为"分子开关"调控基因编辑特异性的物理机制。在CRISPR-Cas9应用中，提示需考虑靶位点局部超螺旋状态以预测脱靶风险；对于错配修复领域，则阐明了染色体拓扑结构可能影响突变累积的新机制。该平台还可拓展至转录调控、DNA重组等研究，为表观遗传学开辟了新的探索维度。