基于Cas12a-FET的免扩增多重病毒核酸全序列检测技术及其在"三重疫情"中的应用

为解决呼吸道病毒共感染导致的诊断难题，韩国科学技术研究院团队开发了一种基于Cas12a介导的场效应晶体管(FET)生物传感器，实现了SARS-CoV-2、RSV和流感A病毒核酸的免扩增、高灵敏度检测。该系统通过ssDNA锚定的扩展栅电极与FET的协同作用，灵敏度较荧光检测提升104倍，并在单芯片上完成三重病毒全序列检测，为多重传染病诊断提供了经济高效的解决方案。

　　

近年来，呼吸道病毒引发的"三重疫情"（triple-demic）给全球公共卫生带来严峻挑战。当SARS-CoV-2、流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）同时流行时，不仅造成医疗资源挤兑，更因病毒共感染导致病情恶化——有研究显示，流感与新冠病毒共感染患者的死亡率显著升高。传统核酸检测依赖靶标预扩增，存在引物偏倚、定量困难等问题；而现有CRISPR-FET技术又受限于单个晶体管仅能检测单一靶标。这些瓶颈严重阻碍了多重病原体的快速精准诊断。

针对这一难题，韩国科学技术研究院的Hyunro Kim、Seuk-Min Ryu等团队在《Sensors and Actuators B: Chemical》发表研究，创新性地将Cas12a的侧切活性与扩展栅场效应晶体管（EG-FET）相结合。研究人员首先通过荧光实验验证了针对BA.1（SARS-CoV-2奥密克戎亚型）、RSV A型和H1N1流感病毒设计的crRNA效率；随后在8联扩展栅电极上固定20nt单链DNA（ssDNA）探针，当Cas12a-crRNA复合物识别靶标后触发ssDNA非特异性切割，引起FET电信号变化。关键技术包括：1）采用模块化扩展栅设计实现"一芯多用"；2）基于导电性筛选电极降低器件间差异；3）优化Cas12a反应体系提升信噪比。

【Cas12a-FET生物传感器设计】
研究团队设计的EG-FET系统包含参考电极和反应电极，后者表面固定ssDNA探针。与传统直接修饰晶体管的方法相比，该设计允许通过更换扩展栅电极而非晶体管本身来检测不同靶标，显著降低生产成本。实验证实，当靶DNA存在时，Cas12a的trans-cleavage（反式切割）活性会导致ssDNA降解，改变电极表面电荷分布并被FET高灵敏度捕获。

【多重病毒检测性能】
在同时检测三种病毒全基因组时，系统对BA.1、RSV A和H1N1的检测限分别达到0.82 fM、1.07 fM和1.23 fM，较荧光法灵敏度提升四个数量级。尤为关键的是，在8联扩展栅的单个芯片上成功实现三重标记同步检测，为临床样本的高通量筛查奠定基础。

【设备均一性优化】
通过建立扩展栅电极导电性筛选标准（ΔV_ref控制在±5 mV内），有效将器件间变异系数从15.7%降至4.3%，大幅提高检测重现性。冷冻干燥技术使ssDNA修饰电极可在4°C稳定保存28天，满足实际应用需求。

该研究开创性地将CRISPR的分子识别能力与FET的电子传感优势相结合，突破现有技术对靶标预扩增的依赖。其创新价值体现在三方面：1）首次实现全序列病毒核酸的免扩增检测，避免PCR引入的定量偏差；2）模块化设计使单个FET可适配多种扩展栅电极，显著降低成本；3）建立标准化电极筛选流程，推动技术产业化。这些突破为应对未来新发突发传染病的多重诊断提供了全新工具，尤其适用于资源有限地区的病原体监测。正如通讯作者Kwan Hyi Lee强调的，这项技术有望成为下一代分子诊断的"游戏规则改变者"。