AAV2递送saCas9基因引发HLA-A*02:01限制性T细胞表位激活及其对基因组编辑的免疫毒性启示

本研究揭示了AAV2载体递送金黄色葡萄球菌Cas9（saCas9）基因后，其催化结构域中高度保守的HLA-A*02:01限制性T细胞表位（GLDIGITSV）可激活CD8+ T细胞并诱导细胞毒性，为CRISPR-Cas9体内基因组编辑的免疫风险提供了关键证据。通过免疫肽组学（immunopeptidomics）和体外T细胞杀伤实验，研究人员证实该表位在49.5%人群相关HLA亚型中具有强结合力，可能影响基因治疗的安全性与疗效。

　　

CRISPR-Cas9技术为遗传病治疗带来革命性突破，但细菌来源的Cas9蛋白可能引发免疫反应这一"阿喀琉斯之踵"始终悬而未决。美国FDA生物制品评价与研究中心的Susana S. Najera团队在《Molecular Therapy Methods》发表的研究，首次通过实验证明：AAV2递送的saCas9基因会在人类细胞中呈现特异性T细胞表位，直接激活杀伤性免疫反应——这一发现为基因编辑疗法的临床转化敲响免疫安全警钟。

研究采用三大关键技术：1）AAV2-saCas9载体设计与体外转导人黑色素瘤细胞系（A375）；2）基于HLA I类分子免疫沉淀联合高灵敏度液相色谱-质谱（LC-MS）的免疫肽组学分析；3）HLA-A*02:01阳性供体PBMC（外周血单个核细胞）扩增及T细胞杀伤实验。样本来源于NIH批准的临床级PBMC库。

结果解析
1. 载体设计与saCas9表达验证
通过改造pAAV-CAG-GFP质粒构建的AAV2-saCas9载体（含CAG启动子和WPRE增强子）在A375细胞中实现剂量依赖性蛋白表达。银染证实病毒衣壳蛋白VP1/2/3比例符合标准（1:1:10），ELISA检测显示MOI 1×10⁶时saCas9表达量最高。

2. 免疫肽组学鉴定关键表位
转导24小时后即检测到7,892条HLA结合肽，其中saCas9来源的GLDIGITSV肽段（RuvC-I核酸酶域活性位点）呈现显著富集。NetMHCpan4.1预测其与HLA-A*02:01结合亲和力最强（IC₅₀=12 nM），且该序列在37种细菌Cas9中高度保守。

3. T细胞激活与杀伤效应
HLA-A*02:01阳性供体的PBMC经该肽段刺激后：

• IFN-γ分泌量提升2.4倍（ELISpot）
• 杀伤性标志物颗粒酶B（granzyme B）表达增加3倍
• 与AAV2-saCas9转导的A375细胞共培养72小时，靶细胞存活率下降87%（CellTiter-Glo验证）

结论与意义
该研究首次在人类细胞模型中证实：AAV递送的saCas9会通过HLA-A*02:01途径呈递免疫优势表位，引发CD8⁺ T细胞介导的清除反应。这一发现具有三重启示：

1. 临床风险预警：约50%欧美人群携带HLA-A*02:01，可能面临基因编辑细胞被免疫清除的风险；
2. 技术优化方向：需开发表位删除（如V16A/L9S突变）或免疫耐受诱导策略；
3. 跨物种差异：小鼠模型可能低估人类免疫风险，强调临床前研究需纳入人源化模型。

研究为CRISPR-Cas9疗法的个体化安全评估提供了分子靶点，也为工程化低免疫原性核酸酶的设计奠定了理论基础。