恶性疟原虫RAP蛋白调控质体非编码RNA加工机制揭示抗疟新靶点

美国加州大学河滨分校团队发现恶性疟原虫(P. falciparum)中PfRAP03和PfRAP08蛋白通过特异性结合质体(apicoplast)rRNA和tRNA调控非编码RNA加工，揭示这两个RNA结合域蛋白(RAP)对寄生虫无性发育的关键作用，为靶向疟原虫独特细胞器的药物设计提供新思路。研究采用CRISPR-Cas9基因编辑、eCLIP-seq等技术发表于《Cell Reports》。

　　

疟原虫作为致命寄生虫，其独特的非光合作用质体(apicoplast)一直是抗疟药物开发的黄金靶点。这个源自次级内共生的细胞器拥有35kb环状基因组，编码30个蛋白质和44个非编码RNA，负责脂肪酸和类异戊二烯合成等关键代谢途径。然而，这个"寄生虫的致命弱点"如何调控其基因表达仍存在巨大知识空白——特别是对于多顺反子转录本的加工机制，科学家们仅鉴定出两个参与RNA处理的五肽重复(PPR)蛋白。美国加州大学河滨分校的Karine G. Le Roch团队在《Cell Reports》发表的研究，首次揭示了RNA结合域富集蛋白(RAP)家族成员PfRAP03和PfRAP08在质体RNA加工中的核心作用。

研究团队采用CRISPR-Cas9技术构建了TetR-DOZI诱导敲降系统，结合转录组分析、免疫沉淀质谱(IP-MS)、杂交纯化质谱(HyPR-MS)和增强紫外交联免疫沉淀测序(eCLIP-seq)等多组学方法。通过同步培养实验和IPP代谢救援验证了靶蛋白功能，Northern blot确认了tRNA加工异常。

研究首先通过基因编辑获得PfRAP03和PfRAP08的HA标签诱导型敲降株。Western blot显示二者表达时相差异：PfRAP08在所有无性阶段均有表达，而PfRAP03仅在晚期阶段检测到。免疫荧光证实二者与质体标志蛋白Cpn60共定位，与线粒体染料MitoTracker信号分离。

PfRAP03和PfRAP08敲降影响寄生虫发育

生长曲线显示，敲降5-6个周期后寄生虫血症显著下降75%（PfRAP03）和55-60%（PfRAP08），呈现典型延迟死亡表型。添加异戊烯焦磷酸(IPP)可完全挽救生长缺陷，证实表型源于质体功能异常。

转录组扰动揭示质体基因表达紊乱

PfRAP03敲降导致8个共享基因显著下调，包括质体编码的伴侣蛋白ClpM(PF3D7_API03600)和核糖体蛋白L2(PF3D7_API01500)。PfRAP08敲降影响更广泛，81个基因表达异常，涉及核糖体蛋白S7/S12和延伸因子Tu等质体编码基因。

蛋白互作网络分析

IP-MS鉴定出PfRAP03与7个蛋白形成复合物，其中3个定位于质体；PfRAP08则与65个蛋白相互作用，包括40个质体相关蛋白，主要富集于核糖体和RNA结合通路。HyPR-MS技术成功捕获到质体rRNA相关蛋白复合物，但未检出目标RAP蛋白。

eCLIP-seq揭示RNA靶标特异性

PfRAP03主要结合质体tRNA和3种mRNA（核糖体蛋白S12、延伸因子Tu和ClpM）；PfRAP08特异性结合大亚基rRNA。Northern blot证实敲降导致缬氨酸tRNA(PF3D7_API05200/PF3D7_API06400)加工异常。

该研究首次阐明RAP蛋白在顶复门寄生虫质体RNA代谢中的分化功能：PfRAP08可能参与rRNA加工和核糖体组装，而PfRAP03调控tRNA成熟及特定mRNA稳定性。这些发现不仅解析了疟原虫独特细胞器的基因调控网络，更重要的是揭示了RAP蛋白作为合成生物学工具的潜力——通过改造其RNA结合特性，未来或可精准操控寄生虫细胞器基因表达，为抗疟策略提供全新干预靶点。正如研究者Thomas Hollin等强调的，这类寄生虫特异的细胞器通路具有重要生物医学价值，为开发靶向质体RNA加工的小分子抑制剂开辟了新途径。