CRISPR/Cas9基因组编辑工具箱在谷氨酸棒杆菌中的应用及次黄嘌呤生物合成研究

为解决谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium stationis)遗传工具匮乏的问题，研究人员开发了高效的CRISPR/Cas9基因组编辑平台。通过优化电转效率(1.81×105 CFU/μg DNA)、构建三种功能性质粒(p99E-pCG1/p19-Kan/p19-Spe)，实现了81.2-98.6%的片段删除和27.5-65.2%的片段插入效率。应用该工具成功构建了次黄嘌呤生产菌株(0.047 g/L)，为棒杆菌属的工业应用提供了重要技术支撑。

　　

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium stationis)作为高GC含量的革兰氏阳性菌，在核苷酸、维生素B₁₂等生物制品生产中具有重要工业价值。然而，该菌种长期面临遗传操作工具匮乏的瓶颈：电转效率低下、可用质粒载体有限、传统同源重组方法效率低且易回复突变。这些限制严重阻碍了对其代谢网络的精准调控和工业化应用开发。

针对这一难题，国内某研究机构的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表了创新性研究成果。研究人员首先系统优化了电转条件：通过筛选LBBHIS培养基、调整脉冲参数(2.5 kV/2脉冲)、优化细胞壁弱化剂浓度(3.0%甘氨酸+0.25%异烟肼)，将转化效率提升至1.81±0.16×10⁵ CFU/μg质粒DNA。同时构建了p99E-pCG1、p19-Kan和p19-Spe三种功能性质粒，其中p99E-pCG1表现出最佳稳定性(94.4%)和中拷贝数(15.2±1.0)。

关键技术包括：1) 采用双LacO*操纵子和弱化P_lac启动子精确调控Cas9表达；2) 开发温度敏感型pBL1ts复制子实现质粒高效清除；3) 结合RecT重组酶实现ssDNA介导的精准编辑(>90%效率)；4) 应用HPLC检测次黄嘌呤产量。

【研究结果】
3.1 电转效率优化
比较四种培养基发现LBBHIS使转化效率较LBS提高4倍。最佳电转参数(2.5 kV/2脉冲/4h恢复)使效率达4.80×10⁴ CFU/μg DNA，优化甘氨酸(3.0%)和异烟肼(0.25%)浓度后进一步提升至1.81×10⁵ CFU/μg。

3.2 基础载体开发
改造的p99E-pCG1质粒在sfGFP报告系统中显示强表达，拷贝数15.2±1.0，稳定性94.4%，显著优于p19系列载体(7.3-9.4拷贝，41-48%稳定性)。

3.3 CRISPR/Cas9系统优化
双LacO*操纵子设计使Cas9泄漏表达降低10倍，在0.1 mM IPTG诱导下实现98.6%的1.7 kb片段删除效率。系统可高效删除50 kb大片段(81.2%)，并完成5 kb外源片段插入(27.5%)。

3.4 ssDNA重组编辑
表达E. coli RecT重组酶后，使用60-nt ssDNA模板即可实现三重核苷酸突变，编辑效率>90%。温度敏感型质粒在34℃培养24h后100%清除。

3.5 次黄嘌呤生物合成
通过删除purA基因(阻断AMP合成)并引入prs^D128A(反馈抗性)和purF^K334Q(解除抑制)，构建的工程菌株产量达0.047 g/L，较初始菌株提高147%。

【结论与意义】
该研究建立了谷氨酸棒杆菌首个高效CRISPR/Cas9编辑平台，解决了高GC含量菌株的遗传操作难题。创新的双LacO*调控策略为其他细菌的Cas9表达控制提供了范式，而开发的质粒工具包(p99E-pCG1等)具有跨物种应用潜力。在代谢工程应用中，通过purA缺失与prs/purF调控的协同作用，证实了该平台在核苷酸衍生物合成中的实用价值。这些突破为棒杆菌属的工业化应用奠定了关键技术基础，特别在维生素B₁₂、核苷类药物等高附加值产品开发中具有广阔前景。未来可进一步拓展碱基编辑、启动子工程等工具，结合组学分析优化代谢网络。