汉逊酵母DL-1精准基因组编辑与多拷贝整合工具的开发及其在β-胡萝卜素和角鲨烯高效合成中的应用

针对汉逊酵母(Hansenula polymorpha) DL-1菌株非同源末端连接(NHEJ)机制强、同源重组(HR)效率低、遗传工具匮乏等问题，研究人员开发了CRISPR-Cas9编辑系统(效率达97.2%)，通过敲除KU80和过表达ScRAD51/52等基因将HR率提升至88.9%，鉴定36个中性位点并建立rDNA/Ty元件多拷贝整合平台，使β-胡萝卜素和角鲨烯产量分别提升60倍和1872倍，为构建高效酵母细胞工厂提供关键技术支撑。

　　

在工业生物技术领域，非传统酵母因其独特的代谢特性成为替代大肠杆菌和哺乳动物细胞的重要生产平台。汉逊酵母(Hansenula polymorpha) DL-1作为耐高温（50°C）甲基营养型酵母，能利用木糖和甲醇等非粮原料，具备高密度发酵优势，但其强NHEJ修复机制和有限的遗传工具严重制约了代谢工程改造。尽管近缘菌株NCYC 495和CBS4732已建立成熟工具，但DL-1因系统发育距离较远且工业适用性突出，亟需专属技术体系突破瓶颈。

针对这一挑战，研究人员系统开发了DL-1菌株的合成生物学工具箱。通过优化gRNA表达策略（固定N6序列为"ATCTGA"），使CRISPR-Cas9对URA3基因的编辑效率提升至97.2%。为克服NHEJ主导的修复倾向，敲除KU80使HIS4无缝缺失效率从4.2%升至33.3%，同时引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HR相关基因（ScRAD51/52/59/SAE2），构建的HR10菌株HR效率达88.9%，可实现500 bp短同源臂整合和10.7 kb多片段体内组装。全基因组筛选鉴定出36个表达稳定的中性位点，eGFP检测显示不同位点表达无显著差异（p>0.05）。基于rDNA（25拷贝）和Ty元件的多拷贝整合系统，配合截短URA3启动子（11 bp）和Cre-loxP标记回收，经三轮迭代使β-胡萝卜素产量从0.2 mg/L提升至12.3 mg/L，角鲨烯产量从0.1 mg/L跃升至187.2 mg/L，37°C发酵显示优良的工业适用性。

关键技术包括：（1）基于RNA pol II启动子PTEF1的CRISPR-Cas9系统构建；（2）KU80敲除联合ScRAD51/52/59/SAE2共表达的HR增强策略；（3）36个中性位点的全基因组筛选与验证；（4）rDNA/Ty元件多拷贝整合工具开发；（5）β-胡萝卜素（GGPPSa/CarRP/CarB）和角鲨烯（tHMG1/ERG20/ERG9）代谢途径的模块化组装。

研究结果部分：
3.1节显示固定N6序列的gRNA设计使编辑效率从23.6%提升至97.2%；
3.2节证实KU80敲除使HR效率提高8倍，HR10菌株可实现11.8%的双片段组装效率；
3.3节通过eGFP报告基因验证36个中性位点的表达稳定性；
3.4节展示多拷贝整合使eGFP荧光强度随迭代轮次递增，qPCR证实拷贝数提升。

结论指出，该研究首次在DL-1菌株实现高效精准编辑（_KU80Δ+ScRAD51/52）、中性位点库构建和多拷贝整合系统三位一体的技术突破，填补了该工业菌株合成生物学工具的空白。特别是rDNA和Ty双轨整合策略，克服了传统rDNA拷贝数限制（25拷贝），为复杂途径（如疫苗佐剂QS-21的38基因组装）提供了可扩展方案。讨论部分强调，DL-1与NCYC 495/CBS4732的生理差异可能带来独特应用价值，未来可结合代谢网络模型进一步优化底盘性能。论文发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，为生物基化学品和药物的高效生产开辟了新途径。