基因组工程与长读长测序技术揭示乳腺癌细胞mRNA中m5C表观转录组的分子特征与调控机制

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑和纳米孔长读长测序技术，系统解析了乳腺癌不同分子亚型中mRNA的5-甲基胞嘧啶(m5C)修饰图谱。研究人员发现NSUN2是m5C关键甲基转移酶，其缺失导致靶基因表达网络紊乱，并首次揭示了乳腺癌亚型特异的m5C甲基化特征。该研究为开发基于表观转录组调控的乳腺癌靶向治疗提供了新思路。

　　

在癌症研究领域，RNA修饰正成为调控基因表达的新维度。其中5-甲基胞嘧啶(m⁵C)作为mRNA重要修饰，通过"writer"(写入酶)、"eraser"(擦除酶)和"reader"(阅读蛋白)的动态调控，影响mRNA稳定性、剪接和翻译过程。然而，传统检测方法如亚硫酸氢盐测序存在RNA降解、假阳性等问题，且m⁵C在乳腺癌中的全转录组分布特征和功能机制尚不明确。针对这一科学问题，Konstantina Athanasopoulou等研究人员在《Functional & Integrative Genomics》发表研究，首次绘制了乳腺癌分子亚型的m⁵C全转录组图谱。

研究团队采用CRISPR/Cas9敲除NSUN2基因，结合纳米孔直接RNA测序技术，对代表不同乳腺癌亚型的5种细胞系(MCF-7、BT-474、SK-BR-3、BT-20和MDA-MB-231)及正常乳腺细胞MCF-10A进行分析。通过靶向DNA测序和Western blot验证敲除效率，利用CHEUI算法分析纳米孔电流信号识别m⁵C位点，并采用mRNA稳定性实验评估NSUN2的功能影响。

研究结果首先揭示了m⁵C在mRNA中的分布特征：在转录组范围内检测到超过10万个m⁵C位点，其中1%为高置信度位点(概率>0.9999)。这些位点主要富集于3'非翻译区(3'UTR)和编码区(CDS)，尤其在剪接位点两侧100-400nt区域呈现显著聚集。空间分布分析显示，11、17和19号染色体编码的mRNA具有更高的m⁵C修饰密度。

通过NSUN2敲除实验证实了其作为主要m⁵C写入酶的关键作用。敲除细胞中5'-CNGGG-3'基序的m⁵C水平显著降低(p<0.001)，同时NSUN2经典靶基因如YBX1、IGF2BP1、ALYREF等在野生型细胞中表达量显著升高。有趣的是，mRNA稳定性实验显示NSUN2对mRNA稳定性的调控具有转录本特异性：虽然NTHL1和PUS1在野生型细胞中更稳定，但DYNLL1和HYSL1却在敲除细胞中表现出更高的稳定性，提示m⁵C可能通过不同机制调控mRNA降解。

乳腺癌亚型分析发现了显著的m⁵C甲基化异质性。与正常乳腺细胞相比，所有癌细胞系均呈现整体高甲基化趋势，其中MCF-7和BT-20变化最为显著(分别有17707和13025个高甲基化位点)。值得注意的是，不同亚型间仅有182个共同m⁵C位点，但功能富集分析显示它们共同参与翻译调控、核糖体组装等通路。KEGG分析进一步揭示这些甲基化转录本富集于ErbB信号、凋亡和DNA修复等癌症相关通路。

该研究首次系统描绘了乳腺癌m⁵C表观转录组景观，确立了NSUN2的核心调控地位，并揭示了亚型特异的甲基化特征。这些发现不仅为理解m⁵C在乳腺癌发生中的作用机制提供了新视角，更重要的是，鉴定出的差异甲基化位点和相关通路为开发基于RNA修饰的乳腺癌分子分型标志物和靶向治疗策略奠定了理论基础。研究采用的纳米孔直接测序技术克服了传统方法的局限性，为表观转录组学研究提供了新的技术范式。未来研究可进一步探索其他m⁵C写入酶的作用，以及m⁵C与其他RNA修饰的协同调控网络，推动精准肿瘤学的发展。