基于高通量图像筛选揭示突触形成调控因子的研究

本研究通过开发高通量光学池化筛选平台，系统解析了神经突触形成的关键调控网络。研究人员采用CRISPR敲除联合异源突触形成实验，对644个突触相关基因进行筛选，鉴定出102个调控突触粘附分子neuroligin-1(NLGN1)功能的关键因子，包括PTEN、DAG1等细胞粘附、细胞骨架和信号通路相关蛋白。该研究建立了研究细胞间相互作用的新型筛选方法，为理解突触发育机制提供了系统性见解。

　　

神经系统的正常功能依赖于精确的突触连接，而突触形成(synaptogenesis)的分子机制尚未完全阐明。虽然已知细胞粘附分子(CAMs)如neuroligin-1(NLGN1)在突触组装中起关键作用，但调控这些分子的功能网络仍不清楚。传统研究方法受限于通量，难以系统解析突触形成的复杂调控网络。针对这一科学问题，来自Broad研究所和麻省理工学院的研究团队开发了创新的高通量筛选平台，相关成果发表在《Cell Reports》上。

研究人员主要运用了三种关键技术：1)光学池化筛选(OPS)技术，实现数百万单细胞的基因型-表型匹配；2)异源突触形成实验系统，将HEK293细胞与海马神经元共培养；3)高内涵成像分析，同时检测兴奋性(VGLUT1⁺)和抑制性(VGAT⁺)突触标志物。

High-content image-based pooled screens reveal regulators of synaptogenesis
研究团队建立了整合CRISPR敲除与异源突触形成实验的高通量筛选平台。通过工程化改造的HEK293细胞表达可诱导Cas9和HA标记的NLGN1，设计靶向644个突触基因的sgRNA文库。共培养系统显示NLGN1敲除或N-cadherin(CDH2)敲除显著减少突触形成，验证了系统可靠性。

High-dimensional phenotypic profiles characterize synapse-organizing roles of NLGN1
通过主成分分析定义"突触形成评分"，整合了Bassoon、VGLUT1和VGAT的 puncta面积和数量特征。PHATE算法可视化显示基因敲除表型可分为影响NLGN1表达和影响突触形成的不同类别。值得注意的是，v-ATPase亚基敲除导致NLGN1表达显著增加但突触形成仅轻微增强。

Identification of positive and negative regulators of NLGN-1-induced synapse formation
筛选鉴定出24个正向调控因子(如PTEN、PFN1)和15个负向调控因子(如CADM1、NSF)。PTEN敲除显著减少突触形成，而突触粘附分子SynCAM 1(CADM1)敲除则增强突触诱导。剪接因子SFPQ敲除产生最显著的突触形成增加，提示蛋白质异构体的重要性。

Candidate NLGN1 regulators implicate transsynaptic, cytoskeletal, and signaling mechanisms in synaptogenesis
102个显著调控因子主要涉及三类机制：1)细胞粘附(如ITGA2、DAG1)；2)细胞骨架动力学(如CFL1、CDC42)；3)信号转导(如Wnt通路组分)。特别发现DAG1选择性调控抑制性突触，而VPS35主要影响兴奋性突触。

DAG1 specifically modulates inhibitory synapses in primary neurons
在原代神经元中验证发现，DAG1敲除特异性减少抑制性突触(gephyrin⁺/VGAT⁺)数量，而不影响兴奋性突触。PTEN敲除则降低AMPA受体(GluA)在突触后膜的聚集，并减少突触小泡循环。

这项研究建立了研究细胞间相互作用的创新筛选平台，系统绘制了突触形成的调控网络。发现PTEN通过PI3K/AKT信号通路调控突触组装，而DAG1作为抑制性突触的特异性调节因子，这些发现为神经发育障碍的研究提供了新视角。研究方法可扩展应用于其他细胞相互作用研究，为复杂细胞生物学过程的机制解析提供了范例。研究不仅揭示了突触形成的多层次调控机制，也为相关疾病的治疗靶点发现奠定了基础。