基于CRISPR/Cas12a系统的"一锅法"快速检测发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)新平台

本研究针对发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测需求，开发了整合重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a系统的"一步法"检测平台。该技术可在45分钟内完成检测，灵敏度达11.7拷贝/反应，与qPCR结果一致性达89.13%，为资源有限地区提供了无需复杂仪器的精准诊断方案。

　　

发热伴血小板减少综合征(SFTS)是由蜱传SFTS病毒引起的急性传染病，死亡率高达30%，目前尚无特效治疗方法。早期准确诊断对疾病防控至关重要。传统PCR检测需要精密仪器，而现有等温扩增技术如LAMP和RPA存在假阳性率高的问题。CRISPR/Cas系统虽具有超高特异性，但传统两步法操作易导致交叉污染。这些技术瓶颈严重制约了SFTSV在基层医疗机构的快速筛查能力。

舟山市岱山县疾病预防控制中心的研究团队在《Virology Journal》发表研究，创新性地将RPA扩增与CRISPR/Cas12a检测整合至单管反应体系，开发出可在恒温条件下45分钟完成的一步法检测平台。该技术靶向SFTSV S基因保守区，通过优化crRNA设计和反应条件，实现了无需复杂仪器的精准检测。

研究采用三项关键技术：1)针对S基因设计三组RPA引物和17种crRNA进行系统筛选；2)使用商业化RAA核酸扩增试剂盒完成逆转录和等温扩增；3)建立50μL单管反应体系，在QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统上监测Cas12a的ssDNA切割活性。46例临床样本验证包含26例SFTSV阳性样本和20例其他病毒感染对照。

【RPA引物和Cas12a crRNA筛选】通过琼脂糖凝胶电泳和荧光强度比较，筛选出扩增效率最佳的SFTSV-3引物(F3/R3)和信号最强的crRNA4。结果显示所有引物均能有效扩增目标序列，其中SFTSV-3引物产物最丰富；在17种crRNA中，crRNA4产生的荧光信号显著优于其他设计。

【反应体系优化】通过浓度梯度实验确定Cas12a和crRNA最佳工作浓度均为500nM。比较四种ssDNA报告基因(8A-FQ/8T-FQ/8C-FQ/8G-FQ)发现，8C-FQ(5'-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3')具有最快的阈值时间和最强信号，被选为最终检测探针。

【灵敏度和特异性评估】梯度稀释实验显示，该方法对SFTSV的检测限(LoD)达11.7拷贝/反应(95%置信区间)。特异性测试表明，系统仅对SFTSV产生显著荧光信号，与基孔肯雅热病毒、乙型流感病毒等6种常见病原体无交叉反应。

【临床样本验证】46例样本检测显示，与qPCR相比，该方法的敏感性和特异性分别为88.46%(23/26)和90.00%(18/20)，总体符合率89.13%。其中3例qPCR阳性样本未被检出，2例qPCR阴性样本出现假阳性。

该研究实现了三大突破：1)首次将RPA与CRISPR/Cas12a整合为单管反应，避免开盖操作导致的污染；2)检测灵敏度较传统RPA方法(241拷贝/反应)提高20倍；3)操作全程仅需恒温设备，适合基层应用。特别值得注意的是，系统采用500nM Cas12a/crRNA复合物和8C-FQ报告基因的优化组合，使检测时间压缩至45分钟，较常规PCR缩短70%以上。

从临床应用角度看，这项技术为SFTSV的现场筛查提供了理想解决方案。其单管封闭设计有效解决了传统等温扩增易污染的问题，而CRISPR/Cas12a的高特异性则弥补了RPA假阳性率高的缺陷。研究者特别指出，该平台采用的S基因靶点在不同SFTSV毒株间高度保守，这对变异病毒的检测具有重要意义。

这项研究不仅为SFTS诊断提供了新工具，更重要的是建立了"一锅法"CRISPR检测的技术范式。通过精确控制Cas12a切割活性与RPA扩增的动力学平衡，实现了扩增与检测的时空耦合。该方法可扩展至其他RNA病毒检测领域，为突发传染病快速诊断技术开发提供了重要参考。未来通过开发冻干试剂和便携式读卡设备，该技术有望成为基层医疗机构的标准化检测方案。