冷休克蛋白基因cspA调控嗜热放线菌Saccharopolyspora pogona生长及丁烯基多杀菌素生物合成的分子机制

为解决丁烯基多杀菌素（butenyl-spinosyn）产量低的问题，研究人员首次通过代谢工程技术对嗜热放线菌Saccharopolyspora pogona的冷休克蛋白基因cspA进行缺失与过表达操作，结合比较蛋白质组学和靶向代谢组学分析，揭示了CspA通过调控前体供应和次级代谢网络显著提升丁烯基多杀菌素产量的机制，为放线菌抗逆性改造提供了新策略。

　　

在农业害虫防治领域，丁烯基多杀菌素（butenyl-spinosyn）作为一种绿色生物农药，因其广谱杀虫特性备受关注。然而，野生型嗜热放线菌Saccharopolyspora pogona的天然产量极低，传统育种方法存在突变逆转风险且效率低下。与此同时，冷休克蛋白（Cold shock proteins, CSPs）作为微生物中高度保守的RNA分子伴侣，虽已知参与低温应激反应，但其在放线菌次级代谢调控中的作用仍是未解之谜。这一矛盾现状促使研究人员思考：能否通过调控CSPs家族关键成员cspA基因，实现对S. pogona代谢网络的精准改造？

针对这一科学问题，中国的研究团队在《Enzyme and Microbial Technology》发表了一项突破性研究。他们首次采用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了cspA基因缺失株（S.pogona-ΔcspA）和过表达株（S.pogona::cspA），结合比较蛋白质组学和靶向代谢组学技术，系统解析了CspA蛋白对菌体生长和丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制。

关键技术方法
研究团队以S. pogona NRRL 30141为对象，通过pKCcas9载体实现cspA基因的过表达，利用pOJ260-UA_cspA-apr-DA_cspA质粒构建缺失株。采用HPLC定量分析丁烯基多杀菌素产量，通过LC-MS/MS进行蛋白质组学检测，并针对聚酮合成前体（如乙酰-CoA、丙二酰-CoA等）开展靶向代谢物分析。

研究结果

1. 菌株构建与表型分析
基因操作证实cspA缺失导致菌体生长迟滞和孢子形成缺陷，而过表达株的生物量提升23%。丁烯基多杀菌素产量在过表达株中达到野生型的2.1倍，表明CspA具有双重调控功能。

2. 蛋白质组学揭示代谢重编程
过表达株中检测到14种与聚酮合成链延伸相关的酶显著上调，包括乙酰-CoA羧化酶（ACC）和甲基丙二酰-CoA变位酶（MCM）。同时，糖基转移酶Gtt和甲基转移酶MetK的表达量分别增加3.2倍和2.8倍，直接促进终产物的修饰效率。

3. 代谢流再定向机制
靶向代谢组显示过表达株内丙二酰-CoA和甲基丙二酰-CoA库容扩大1.7倍，这些聚酮合成关键前体的积累为碳链延伸提供充足底物。值得注意的是，三羧酸循环（TCA）中间体减少，表明碳流向次级代谢途径分流。

4. 抗逆性增强效应
过表达株在42℃高温下的存活率提高35%，暗示CspA可能通过稳定mRNA二级结构维持应激相关蛋白（如热激蛋白Hsp90）的翻译效率。

结论与意义
该研究首次证实cspA是调控S. pogona生长-次级代谢平衡的核心开关：一方面作为RNA伴侣优化核糖体功能，另一方面通过增强前体供应和修饰酶活性推动丁烯基多杀菌素合成。这一发现不仅为理解放线菌中CSPs的非经典功能提供了实验依据，更开创了通过单基因操作同步提升产物产量和菌株抗逆性的新策略。技术层面，建立的CRISPR/Cas9编辑体系为后续S. pogona遗传改造提供了标准化工具。从应用角度看，研究提出的"代谢前体-修饰酶协同强化"模型，可推广至其他聚酮类抗生素的高产菌株构建，具有重要的工业转化价值。