基于单细胞多组学技术解析人巨细胞病毒特异性CD8+T细胞的分子特征与免疫应答机制

这篇研究通过BD Rhapsody平台开发了标准化五维单细胞多组学工作流（含转录组、TCR序列、抗原特异性、表面蛋白和样本多重标记），创新性整合测序型dCODE dextramers技术，实现了对罕见抗原特异性T细胞的高灵敏度检测。该研究不仅系统表征了人CMV特异性CD8+T细胞的克隆异质性（包括pp65495-503、IE-1309-317等表位），还建立了双层级标记策略（flex-tag+Sample-tag），为感染免疫研究和肿瘤疫苗开发提供了重要技术范式。

　　

单细胞多组学技术揭示CMV特异性T细胞特征

Motivation
传统单细胞多组学技术在整合转录组、TCR序列、抗原特异性等多模态数据时面临标准化挑战。本研究基于BD Rhapsody平台开发了可同时捕获全转录组（WTA）、TCR序列、抗原特异性（通过dCODE dextramers）、31种表面蛋白（AbSeq）和双重样本标记（flex-tag+Sample-tag）的五维分析流程，为解析抗原特异性T细胞的异质性提供了新工具。

Highlights
• 创新性建立双层级标记策略：首次将flex-tag（识别样本来源）与常规Sample-tag（区分染色条件）结合，实现复杂实验设计的精准解卷积。
• 灵敏度突破：dCODE dextramers可检测频率低至1.67%的CMV特异性T细胞（DexA灵敏度75.8%，特异性100%）。
• 技术验证：通过NLV克隆（HLA-A02:01/pp65_495-503）和CRV克隆（HLA-C07:02/IE-1_309-317）的平行流式对比，证实测序与流式结果高度一致。

Single-cell multi-omics分析
实验设计采用5%和50%两种比例将CMV特异性细胞（NLV克隆、TPR富集样本、CRV克隆）"spike-in"到健康供体背景中。通过wnnUMAP可视化发现：
• 背景CD8⁺T细胞形成naive、中央记忆（T_CM）、效应记忆（T_EM）和TEMRA四个主要亚群
• CMV克隆细胞显著高表达激活标志物HLA-DR、ICOS和CD56（NCAM1）
• 技术批间差异可忽略（Pearson相关系数>0.99）

CMV特异性CD8⁺T细胞表征
通过k-means聚类设定Dex⁺阈值（DexA=3.94 CLR值）：
• NLV克隆中75.8%细胞为DexA⁺，携带特征性TCRβ链CASSPKTGTIYGYTF（TRBV6-5/TRBJ1-2）
• CRV克隆中84.8%细胞为DexC⁺，其TCRα链CAASEAAGNKLTF（TRAV29/DV5）与文献报道完全一致
• 发现CD158b（KIR2DL2/3）与DexC无交叉反应，排除非特异性结合

TCR组库分析
基于BLOSUM62矩阵的CDR3氨基酸相似性聚类发现：
• NLV克隆形成两个clonotype簇（#1和#15），共享β链但具有不同α链（CVRNRDDKIIF vs CARNTGNQFYF）
• TPR富集样本中鉴定到新型pp65_417-426特异性TCR：α链CATVLRMDSSYKLIF（TRAV17-TRAJ12）与β链CASSLLGISTYNEQFF（TRBV7-9）
• 通过VDJdb比对验证了CRV克隆TCR对IE-1表位的特异性

Discussion
该工作流相比sci-RNA-seq等固定细胞方法具有三大优势：
1）保留细胞活性实现功能性研究
2）双标记策略支持大规模样本筛查
3）无需预富集即可检测未知抗原特异性
局限性包括：
• 不同实验室的Dex⁺判定标准需统一（建议采用ICON框架）
• TCRα/β链配对率仅25%，需优化引物设计

技术应用前景
该方法已成功应用于：
• CMV疫苗候选表位验证
• 肿瘤新生抗原筛选
• 自身免疫病致病性T细胞追踪
研究者开源了分析代码（Zenodo:10.5281/zenodo.15423937），为领域内建立标准化分析流程提供重要参考。