利用抗CRISPR蛋白AcrIIA4增强CRISPR/Cas9系统在野生型芽孢杆菌中的基因组编辑效率

本研究针对野生型芽孢杆菌中CRISPR/Cas9系统因Cas9/sgRNA复合物毒性导致编辑效率低下的难题，创新性地引入抗CRISPR蛋白AcrIIA4构建CRISPR/抗CRISPR（CAC）系统。通过双诱导型启动子（Pspac-cas9/Pxyl-acrIIA4）精确调控Cas9活性，在Bacillus subtilis等5种野生菌株中实现转化效率最高提升139倍，编辑效率达95.8%，为未驯化微生物的基因改造提供了通用工具。

　　

在微生物工程领域，野生型芽孢杆菌因其卓越的环境适应性和丰富的次级代谢产物，成为工业酶制剂、抗生素生产的明星菌株。然而这些"野性难驯"的微生物面临基因改造困境——传统CRISPR/Cas9系统在野生菌株中引发强烈毒性，导致转化效率断崖式下跌。这种毒性源于Cas9/sgRNA复合物造成的DNA双链断裂(DSBs)，而野生菌株缺乏活跃的非同源末端连接(NHEJ)修复机制。尽管碱基编辑器(CBEs)能避免DSBs，但其脱靶突变风险限制了应用。如何打破这一技术壁垒，成为韩国生物科学与生物技术研究院团队亟待攻克的关键科学问题。

该团队创新性地从噬菌体"军备竞赛"中获得灵感，将天然CRISPR抑制因子AcrIIA4整合到编辑系统中。这种来自单核细胞增生李斯特菌的抗CRISPR蛋白，能特异性结合Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物，阻断其与DNA相互作用。研究人员构建了包含双诱导系统的CAC质粒：cas9基因受P_spac启动子调控，acrIIA4基因由P_xyl控制，配合lacI/xylR阻遏蛋白实现精确时空调控。木糖诱导阶段激活AcrIIA4表达保护细胞，IPTG诱导阶段释放Cas9活性完成编辑，这种"分子开关"设计巧妙规避了持续毒性。

关键技术包括：1）采用接合转移和自然转化两种方式递送CAC系统；2）针对spo0A等靶基因设计同源重组模板；3）通过启动子工程优化表达调控；4）在Bacillus subtilis 168、B. subtilis 1028、B. pumilus等5种野生菌株中验证系统普适性。

控制AcrIIA4在驯化芽孢杆菌中对Cas9活性的调控
实验室模式菌株B. subtilis 168的测试显示，缺乏AcrIIA4时转化效率极低（<10² CFU/μg DNA），而木糖诱导可使效率提升82倍。引人注目的是，即便无诱导剂，AcrIIA4的泄漏表达也能产生20倍增强效果，证实其基础保护作用。

AcrIIA4助力野生型芽孢杆菌基因组编辑
在野生型B. subtilis 1028中，CAC系统使接合效率暴增139倍。编辑效率呈现显著诱导依赖性：木糖组为0%，IPTG组达95.8%，证明时空调控的成功。B. pumilus中同样观察到73倍转化效率提升和100%编辑效率。

拓展应用至其他芽孢杆菌
通过PCR验证，研究成功在B. mojavensis、B. tequilensis和Paenibacillus polymyxa中实现spo0A基因敲除。尽管这些菌株转化效率难以量化，但基因型分析确认了编辑事件的发生。

这项研究开创性地将噬菌体防御机制转化为基因编辑工具，突破性地解决了野生菌株CRISPR编辑的世界性难题。CAC系统的核心价值在于：1）首次证明AcrIIA4能有效中和Cas9毒性；2）建立通用型双诱导调控框架；3）为90%缺乏NHEJ系统的微生物提供编辑方案。该技术不仅推动芽孢杆菌的工业应用，其"先保护后编辑"的策略更为微生物基因组工程开辟新范式。正如作者Man Su Kim和Da-Eun Jeong强调的，这项研究标志着抗CRISPR蛋白从基础生物学发现向生物技术应用的华丽转身。