基于CRISPR/Cas12a侧切活性和toehold介导DNA扩增的超灵敏碱性磷酸酶检测新策略

本研究针对传统碱性磷酸酶(ALP)检测方法灵敏度低、选择性差的问题，创新性地将CRISPR/Cas12a侧切活性与toehold介导DNA链置换信号放大技术相结合，开发出检测限低至1.61 U L?1的电化学发光(ECL)生物传感器，为临床诊断和酶活性监测提供了新工具。

　　

碱性磷酸酶(ALP)是参与骨矿化、免疫应答等生理过程的关键酶，其活性异常与肝病、癌症等多种疾病密切相关。然而传统检测方法如比色法、荧光法在复杂生物基质中面临灵敏度不足的挑战。苏州大学附属第二医院等机构的研究团队在《Microchemical Journal》发表研究，通过整合CRISPR/Cas12a的侧切活性和toehold介导DNA扩增技术，构建了新型电化学发光生物传感器。

关键技术包括：1）设计5'-磷酸化单链DNA(ssDNA)探针作为ALP响应元件；2）λ外切酶控制下的杂交链式反应(HCR)信号放大；3）Cas12a/crRNA复合物激活的Ru-DNA1报告分子切割；4）电化学发光信号检测系统。

【研究结果】

1. 工作原理：ALP通过去磷酸化保护ssDNA探针免受λ外切酶降解，释放的a*序列触发HCR生成长链DNA，进而激活Cas12a的侧切活性，切割Ru-DNA1产生ECL信号。
2. 性能验证：传感器对ALP的检测限达1.61 U L^?1，较传统方法灵敏度提升2个数量级，在血清等复杂基质中保持优异特异性。
3. 临床应用：成功检测肝病患者血清样本，结果与ELISA法高度一致(r=0.992)。

【结论与意义】
该研究首次实现CRISPR/Cas12a与toehold介导DNA扩增的协同应用，突破传统ALP检测的灵敏度瓶颈。Mengmeng Wang等开发的生物传感器具有三大优势：1）双重信号放大使检测限达亚单位级；2）CRISPR系统赋予超高特异性；3）电化学发光平台便于临床转化。这项工作不仅为ALP相关疾病诊断提供新工具，更拓展了CRISPR在非核酸靶标检测中的应用边界，为其他生物标志物的超灵敏检测提供了范式。研究获得苏州科技计划(SKYD2023187/88)等基金支持。