基于内源启动子LarPE004的高效CRISPR-Cas系统在日本落叶松基因组编辑中的开发与活性评价

为解决日本落叶松(Larix kaempferi)因基因组杂合度高、遗传转化困难导致的基因编辑效率低下问题，研究人员通过优化原生质体制备体系（活性>90%，转化效率40%）和筛选内源启动子LarPE004，构建了高效的LarPE004::STU-Cas9系统。该系统单基因编辑效率达8%（LarbHLH03位点），多基因编辑效率达8.2%，且SpRY变体可编辑非典型PAM序列，为针叶树功能基因组研究和分子育种提供了新工具。

　　

日本落叶松作为我国重要造林树种，其漫长的生命周期（>20年）和高度杂合的基因组特性，使得传统育种面临周期长、效率低的困境。尽管CRISPR-Cas9技术已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)等模式植物中广泛应用，但在针叶树中仍存在启动子活性不足（如CaMV 35S在落叶松中表达量仅为内源启动子LarPE004的1/3）、原生质体转化效率低（<10%）等技术瓶颈。这些限制严重阻碍了落叶松基因功能研究和性状改良进程。

中国林业科学研究院的研究团队通过整合全基因组与转录组数据，从819个高表达转录本中筛选出41个候选启动子，最终鉴定出活性显著优于常规启动子的LarPE004（驱动GFP表达量比ZmUbi1高1.8倍）。研究人员建立了落叶松原生质体高效转化体系（6小时酶解，0.4 mol·L^-1甘露醇，20% PEG4000），并创新性地构建了单转录单元系统LarPE004::STU-Cas9。该系统通过LarPE004同时驱动Cas9和sgRNA表达，避免了外源U6启动子在落叶松中的低效问题。

关键技术包括：（1）基于Wtdbg2和Trinity的基因组-转录组联合分析；（2）0.4 mol·L^-1甘露醇优化的原生质体制备；（3）Golden Gate组装策略构建多基因编辑载体；（4）Illumina Hiseq 2500平台的高通量编辑效率检测。

3.1 高效原生质体瞬时表达系统的建立
通过优化酶解条件（1.5% Cellulase R-10 + 0.4% Macerozyme R-10）和转化参数，获得活性>90%、转化效率40%的原生质体，满足编辑系统评估需求。

3.2 高活性内源启动子的挖掘
LarPE004在落叶松原生质体中GFP表达量比CaMV 35S高2.1倍，其截短体LarPE004-1（缺失510 bp）仍保持全长90%活性，且在杨树中展示组成型表达特性。

3.3 不同表达系统的编辑效率比较
LarPE004::STU-Cas9在LarbHLH03位点编辑效率（8%）显著高于TTU系统（1.9%）和CaMV 35S系统（2%），证明单转录单元设计优势。

3.4 多基因编辑能力验证
针对LarbHLH03等4个基因的同步编辑效率达8.2%，且相邻sgRNA可提升单基因编辑效率（LarCKX01三位点编辑效率4.6% vs 单点1.5%）。

3.5 SpRY变体的PAM灵活性
LarPE004::STU-SpRY成功编辑非典型PAM（如TTT、GTG），在LarNAC02-TGG位点效率达4.1%，拓展了编辑靶点范围。

该研究突破了针叶树基因编辑的两大技术壁垒：一是建立了首个落叶松高效原生质体评价体系，为快速验证编辑系统提供平台；二是内源启动子LarPE004的发现解决了外源启动子"水土不服"的问题。值得注意的是，LarPE004在杨树中的跨物种活性暗示其在木本植物中具有普适性价值。未来可通过挖掘更多组织特异性启动子（如维管形成层特异表达基因启动子），进一步精准调控木材形成相关性状。研究团队提出的"多靶点协同编辑"策略，为落叶松多基因调控网络研究提供了新思路，对加速针叶树分子育种进程具有里程碑意义。论文发表于《Horticultural Plant Journal》，为森林树种基因编辑研究提供了可复制的技术范式。