Senataxin与DNA-PKcs协同促进V(D)J重组中DNA双链断裂的非同源末端连接修复

研究人员针对DNA双链断裂(DSB)修复中非同源末端连接(NHEJ)通路的冗余调控机制，通过CRISPR-Cas9全基因组筛选发现RNA解旋酶Senataxin(SETX)与DNA-PKcs激酶功能冗余，共同调控V(D)J重组过程中的RAG-DSB修复。该研究首次揭示ATM和DNA-PKcs分别通过Senataxin和RECQL5/HLTF形成两条平行通路支持NHEJ，为免疫缺陷疾病和基因组不稳定性相关疾病的机制研究提供新视角。

　　

在淋巴细胞发育过程中，V(D)J重组通过RAG核酸酶产生DNA双链断裂(DSB)，依赖非同源末端连接(NHEJ)通路完成修复。尽管已知ATM和DNA-PKcs激酶通过冗余途径调控NHEJ，但二者下游的具体效应分子仍不明确。尤其令人困惑的是，DNA-PKcs激酶活性抑制在V(D)J重组中仅表现出微弱表型，暗示存在未知补偿机制。

来自国外的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究中，通过CRISPR-Cas9全基因组筛选发现RNA解旋酶Senataxin(SETX)在DNA-PKcs抑制条件下对RAG-DSB修复至关重要。研究采用基因编辑构建多种突变细胞系（包括^3HA/3HA标签和激酶失活突变体），结合Southern blot、流式细胞术和二代测序等技术，系统揭示了SETX与RECQL5/HLTF形成两条平行通路：ATM-SETX通路与DNA-PKcs-RECQL5/HLTF通路，二者功能冗余地支持NHEJ。

主要技术方法

1. CRISPR-Cas9全基因组筛选鉴定NHEJ相关基因；
2. 构建^Setx-/-、^Recql5-/-、^Hltf-/-等多基因敲除的abl前B细胞系；
3. 通过pMG-INV和pMX-DEL重组报告系统监测V(D)J重组效率；
4. Southern blot分析信号末端(SE)和编码末端(CE)修复动态；
5. 高通量测序解析连接接头结构变异。

Senataxin是DNA-PKcs缺陷型abl前B细胞中RAG-DSB修复所必需的
CRISPR筛选显示^Setx gRNA在DNA-PKcs抑制剂NU7441处理的细胞中显著富集。Southern blot证实^Setx-/-细胞在NU7441处理下出现SE/CE修复缺陷，而ATM抑制剂KU55933无此效应，提示SETX与DNA-PKcs通路特异性关联。

Senataxin解旋酶活性为NHEJ所需
激酶结构域突变体^{SetxK1945R/K1945R}和^{L2131W/L2131W}丧失修复功能，证实其ATP酶和RNA结合活性对NHEJ不可或缺。

Senataxin与RECQL5和HLTF解旋酶功能冗余
次级筛选发现^Recql5-/-使^Setx-/-细胞修复缺陷加剧，三重突变^{Setx-/-Recql5-/-Hltf-/-}导致SE积累达野生型的3倍。免疫共沉淀显示RECQL5与HLTF存在组成型相互作用。

ATM活性是^{Recql5-/-Hltf-/-}细胞中RAG-DSB修复所需
ATM抑制在三重突变体中引发显著修复障碍，而DNA-PKcs抑制主要影响^Setx-/-细胞，证实两条通路的平行调控关系。

RNA聚合酶II活性部分抑制改善解旋酶缺陷细胞的NHEJ
CDK7抑制剂THZ1处理可减少突变体中未修复SE比例，提示转录相关核酸结构可能是这些解旋酶的清除靶点。

解旋酶缺陷细胞中的异常DNA末端连接
测序显示突变体信号接头(SJ)出现长片段缺失(>10bp)和微同源使用频率升高（野生型1% vs 突变体23%），表明修复转向易错机制。

这项研究首次阐明ATM和DNA-PKcs通过调控不同解旋酶/转位酶形成互补通路，为理解NHEJ的精细调控提供了新范式。发现SETX-RECQL5-HLTF网络在维持淋巴细胞基因组稳定性中的关键作用，为共济失调毛细血管扩张症等DNA修复缺陷疾病的治疗靶点开发奠定基础。研究还揭示转录相关核酸结构可能是NHEJ的重要屏障，为肿瘤放疗增敏策略提供新思路。