糖胺聚糖通过结构特异性抑制CRISPR-Cas9活性的机制研究及其基因编辑安全调控意义

本研究针对CRISPR-Cas9系统在临床应用中的脱靶效应风险，首次揭示了硫酸化糖胺聚糖(GAGs)对Cas9的抑制作用。研究人员通过构建不同分子量、磺化位点（C6-硫酸化/N-硫酸化）的GAGs文库，结合分子动力学模拟，证实肝素(HP)和硫酸软骨素(CS)能通过占据DNA结合位点抑制Cas9活性，其中高磺化度、高分子量GAGs效果更显著。该发现为开发碳水化合物类CRISPR-Cas9抑制剂提供了新思路，对提升基因编辑安全性具有重要价值。

　　

基因编辑技术CRISPR-Cas9以其精准高效的特性彻底改变了生命科学领域，但其不可控的活性导致的脱靶效应如同"基因剪刀"可能误伤非目标DNA，成为临床应用的重大安全隐患。尽管已有抗CRISPR蛋白(Acr)和小分子抑制剂如BRD0539等调控手段，但存在免疫原性或调控灵活性不足等问题。在此背景下，糖胺聚糖(GAGs)这类天然多糖因其结构多样性和强负电性进入研究视野——此前研究已发现肝素能抑制CRISPR-Cas12a，那么它对Cas9是否也有类似效果？这种抑制是否与GAGs的磺化程度、分子量等结构特征相关？

为解答这些问题，中国研究人员开展了一项开创性研究。通过自由基降解系统构建了包含透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)和肝素(HP)的GAGs文库，获得不同分子量片段（如HP F1-F4）。结合凝胶电泳、荧光报告系统等实验，发现CS和HP能显著抑制Cas9活性，且HP的抑制效果呈现浓度依赖性。分子动力学模拟揭示HP可能通过其硫酸基团抢占Cas9的关键DNA结合域发挥作用。进一步研究发现：C6-硫酸化的CS比C4-硫酸化抑制效果更强，HP的N-硫酸化修饰也能增强抑制活性；相同磺化度下，高分子量GAGs（如15-20 kDa）比低分子量片段（3-5 kDa）效果提升2-3倍。这些发现发表于《Carbohydrate Polymers》，首次系统阐明了GAGs结构特征与Cas9抑制活性的定量关系。

关键技术包括：1) 采用H₂O₂/L-VitC自由基降解体系制备不同分子量GAGs片段；2) 通过荧光素酶报告系统定量检测Cas9活性；3) 分子对接与分子动力学模拟分析GAGs-Cas9相互作用位点；4) 多糖结构表征技术（凝胶色谱、红外光谱等）解析磺化度与分子量。

【探索GAGs对CRISPR-Cas9活性的抑制作用】
实验证实非硫酸化的HA无抑制效果，而CS和HP显著降低Cas9切割效率。浓度梯度实验显示10 μg/mL HP即可抑制50%活性，且存在剂量效应。

【分子量对抑制活性的影响】
高分子量HP片段（15-20 kDa）的抑制率比3-5 kDa片段高32%，表明长链GAGs更易形成多点结合。CS也呈现类似规律，20 kDa片段效果最佳。

【磺化位点的关键作用】
C6-硫酸化CS的抑制效果比C4-硫酸化高40%，HP的N-硫酸化修饰使抑制率提升25%，证实硫酸基团位置直接影响结合能力。

【分子机制研究】
模拟显示HP硫酸基团与Cas9的HNH核酸酶域中Arg⁷⁸⁰、Lys⁸⁴⁸等正电残基形成盐桥，可能阻碍DNA底物接近活性中心。

这项研究不仅首次建立了GAGs结构参数（分子量、磺化位点/程度）与CRISPR-Cas9抑制活性的定量关系模型，更开辟了多糖类CRISPR抑制剂的新研究方向。相比传统蛋白类抑制剂，GAGs具有低免疫原性、结构可调等优势，其明确的构效关系为设计"可编程"抑制剂奠定基础。未来通过优化磺化模式（如设计C2/C6双磺化CS）或构建GAGs-小分子杂合体，有望开发出时空特异性更强的基因编辑调控工具。该成果对CRISPR技术在遗传病治疗、癌症免疫疗法等场景的安全应用具有重要指导价值。