基于多功能标记引物的免crRNA输入与PAM依赖的通用型单管CRISPR检测技术TOP-CRISPR的研发及其在细菌感染即时诊断中的应用

为解决传统RPA-CRISPR/Cas12a检测中crRNA稳定性差、PAM依赖性强及多步操作易污染等问题，研究人员开发了标记引物介导的单管CRISPR检测技术（TOP-CRISPR）。该技术通过T7 RNA polymerase原位生成crRNA，利用引物标签序列激活Cas12a，实现了免crRNA输入、PAM非依赖的闭管操作，灵敏度达1 CFU/mL，检测时间<50分钟，成功应用于金黄色葡萄球菌等病原体检测，为细菌感染即时诊断提供了新工具。

　　

细菌感染是全球发病率和死亡率的重要诱因，每年导致约770万人死亡。传统培养法耗时长达数天至一周，qPCR虽快速但依赖专业实验室设备，难以满足急诊需求。CRISPR/Cas12a技术的出现为分子诊断带来革新，但其与重组酶聚合酶扩增（RPA）联用时面临crRNA易降解、需PAM序列激活、多步操作导致气溶胶污染等挑战。现有解决方案如空间分离法、光控crRNA等存在成本高或操作复杂等局限。

安徽医科大学等机构的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表研究，提出TOP-CRISPR技术。该技术通过设计含crRNA模板区、启动子区和特异性引物区的标记引物（Tag-FP），在RPA扩增时同步生成dsDNA，经T7 RNA polymerase转录产生crRNA。关键创新在于Cas12a/crRNA复合物被引物标签序列而非靶标amplicon激活，从而规避PAM依赖性和靶序列破坏问题。

研究采用三步关键技术：1）设计含通用标签的引物系统；2）优化单管RPA-CRISPR/Cas12a反应体系；3）验证三种细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、铜绿假单胞菌）的检测性能。临床样本测试表明，该方法灵敏度较传统方法提升显著。

Construction of the TOP-CRISPR
电泳验证显示标记引物使amplicon分子量增加64 bp（图1A），且T7转录生成的crRNA与标签序列完全互补。荧光动力学曲线证实Cas12a仅被Tag-FP激活（图1C），而传统PAM依赖体系需靶标直接激活。

Analytical Performance
优化后体系检测限达1 CFU/mL，较两步法灵敏度提高10倍（图2B）。闭管操作避免气溶胶污染，全程耗时<50分钟，较常规方法缩短30%。

Detection of Real Samples
在138例临床样本中，TOP-CRISPR与qPCR符合率98.6%（表2），且能区分近缘菌种，显示优异特异性。

Conclusion
TOP-CRISPR通过三大突破推动CRISPR诊断实用化：1）消除crRNA存储难题；2）实现RPA与CRISPR/Cas12a的单管兼容；3）摆脱PAM限制。该技术为POCT提供了通用平台，作者团队Qun Ni、Xiaofan Zhu等指出其可扩展至病毒检测等领域。基金支持来自国家重点研发计划（2022YFF1102900）等7个项目。

研究意义在于：首次将引物标签同时作为crRNA模板和Cas12a激活剂，解决了CRISPR诊断在稳定性、通用性和便捷性上的核心痛点。未来通过引物库扩展，有望建立覆盖更多病原体的即时检测体系。