结构动力学调控的理性工程策略显著增强Cas9核酸酶靶标特异性

本研究针对CRISPR-Cas9系统存在的脱靶切割问题，提出了一种基于中间态稳定的新型理性设计策略。通过向Cas9非催化REC2结构域引入带正电荷氨基酸，研究人员成功增强了REC2-DNA在非活性中间构象的相互作用，开发出Correct-Cas9变体。高通量分析显示，该变体在人类细胞中显著降低脱靶效应，同时保持较高靶标活性，为核酸酶特异性优化提供了全新方法论。

　　

基因编辑技术CRISPR-Cas9虽已广泛应用于基础研究和临床治疗，但其脱靶效应始终是制约临床应用的关键瓶颈。传统优化策略主要聚焦于破坏蛋白-核酸相互作用以降低"过剩稳定能"，但这种"减法"式设计往往导致靶标活性显著下降。现有高保真变体如eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1在数千个靶序列测试中，脱靶切割率仍平均超过其靶标活性的33%，而evoCas9等变体虽特异性优异却存在严重活性缺陷。

针对这一困境，首尔大学、延世大学等机构的研究团队另辟蹊径，提出了"中间态稳定"的创新策略。不同于传统方法破坏活性构象(AE-S)的稳定性，该研究着眼于稳定酶-底物复合物的非活性中间态(IE-S)，通过结构动力学调控实现更精准的脱靶隔离。研究团队基于前期单分子研究发现——Cas9的REC2结构域在非活性中间构象(I)中会与解链的非靶链(NTS)特异性结合，精心设计了系列REC2电荷反转变体（REC2-K1至REC2-K4），将REC2表面带负电氨基酸替换为带正电赖氨酸。

研究采用单分子FRET(smFRET)技术、体外切割实验、靶向深度测序和高通量筛选等关键技术方法。其中单分子平台可实时观测Cas9构象变化，而包含7567对gRNA-靶序列对的三种慢病毒文库（Library A-C）系统评估了变体活性。人类HEK293T细胞模型用于验证生理条件下的编辑效率。

结构动力学调控增强酶特异性
通过建立包含中间态的多步动力学模型，研究阐明传统"过剩能量"策略通过破坏AE-S实现特异性提升，而新策略则通过稳定IE-S增强脱靶隔离。理论计算表明两种策略存在协同效应，为组合设计奠定基础。

REC2-K变体的理性设计
晶体结构分析锁定REC2表面E223/E232和D257/E260/D261两个负电区域。构建的REC2-K4变体（五个位点突变为赖氨酸）在体外切割实验中，对含2个PAM远端错配的脱靶DNA（M18-19）切割效率降至背景水平（7%），而靶标活性保持>80%。smFRET证实REC2-K4能选择性将脱靶DNA"冻结"在I构象（P_I/P_A比值达19），而靶标DNA仍可正常转为A构象。

人类细胞中的特异性验证
在七个内源位点测试中，REC2-K4显著降低GN19和gN19 sgRNA引导下的脱靶indel频率。特别对于5'端错配的gN19 sgRNA，其靶标活性（平均45%）显著高于eSpCas9(1.1)（<10%），展现更好的临床应用潜力。

组合变体Correct-Cas9的开发
将REC2-K3突变与SpCas9-HF1关键突变（Q695A/Q926A）组合，创建Correct-Cas9（意为"结合理性设计的REC-Two"）。高通量分析显示，该变体在单碱基错配靶点的特异性（0.89）超越亲本变体SpCas9-HF1（0.87），对连续2-3碱基错配的抑制效果尤为突出（相对切割频率<0.05）。

这项研究不仅开发出性能优异的Correct-Cas9变体，更重要的是建立了"中间态稳定"这一普适性理性设计框架。该策略可拓展至其他经历构象变化的核酸处理酶（如碱基编辑器、先导编辑器等），为精准基因编辑工具开发提供了全新范式。论文创新性地将单分子动力学研究与高通量功能筛选相结合，为酶工程领域树立了多尺度研究典范。研究结果发表于《Nucleic Acids Research》，为解决CRISPR-Cas9脱靶这一"卡脖子"问题提供了中国方案。