CRISPR-Cas12a小型crRNA库增强系统：汉坦病毒M基因超灵敏即时检测新策略

本研究针对CRISPR-Cas12a诊断系统存在的灵敏度不足、交叉污染风险及扩增-检测步骤不兼容等问题，开发了小型crRNA库增强平台（SLCC）。通过机器学习指导的crRNA设计、多crRNA协同信号放大和单管RT-RPA/CRISPR整合技术，实现了汉坦病毒M基因0.086 pM的检测限（LoD），较单crRNA系统提升85倍，为资源有限地区的病原体检测提供了高效解决方案。

　　

在传染病防控领域，核酸检测技术始终扮演着关键角色，但传统方法如PCR和ELISA各自存在明显短板。PCR虽灵敏特异，却依赖精密仪器和实验室环境；ELISA便于现场使用，却常受交叉反应困扰。近年来，等温核酸扩增技术（INA）与CRISPR-Cas系统的结合为分子诊断带来新机遇，但扩增与CRISPR检测步骤的不兼容性、操作复杂性等问题严重阻碍其临床应用。

针对这些挑战，国内研究人员在《Sensing and Bio-Sensing Research》发表了一项突破性研究。他们开发了小型crRNA库CRISPR-Cas12a（SLCC）平台，通过三大创新实现了汉坦病毒M基因的超灵敏检测：机器学习指导的crRNA靶向设计、多crRNA协同信号放大技术，以及整合逆转录、重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）和CRISPR检测的单管工作流。

研究采用机器学习算法筛选crRNA序列，通过体外转录制备crRNA，建立单管RT-RPA/CRISPR反应体系。利用临床样本和合成核酸验证性能，通过实时荧光定量和侧流层析试纸评估灵敏度与特异性。

3.1 紧凑型crRNA库设计
研究人员针对汉坦病毒M基因保守区设计8条crRNA，通过协同作用使单个dsDNA底物可同时激活多个CRISPR-Cas12a复合物，显著增强ssDNA荧光探针的切割效率。

3.2 单crRNA切割活性筛选
从8条候选crRNA中筛选出6条高活性序列，单crRNA系统平均检测限（LoD）为7.31 pM，证实了Cas12a对未扩增靶标的固有检测局限。

3.3 组合crRNA活性优化
六crRNA组合（crRNA4+5+6+29+30+31）实现0.086 pM的LoD，较单crRNA系统灵敏度提升85倍，且信号在45分钟内达到平台期。

3.4 DNA水平检测验证
两管法RPA-SLCC系统对DNA的检测限达0.44 fM；单管法则展现1.25 pM的LoD，证实多crRNA策略可缓解低浓度下的信号衰减。

3.5 RNA水平性能评估
单管RT-RPA-SLCC系统对RNA的LoD为7.51 pM，较单crRNA系统提升42.6倍；侧流试纸检测灵敏度达500 pM，实现10-20倍提升。

3.6 临床特异性验证
系统对SARS-CoV-2、HBV和肺炎支原体均无交叉反应，与qPCR结果一致性达90%，证实其临床可靠性。

这项研究通过创新性整合多crRNA策略与单管工作流，成功突破了CRISPR诊断技术的核心瓶颈。其重要意义体现在三方面：首先，机器学习指导的crRNA设计为靶向保守区域提供新范式；其次，多crRNA协同机制将Cas12a的附带切割活性转化为可编程的信号放大器；最后，单管设计显著降低污染风险，使超灵敏检测在资源有限地区成为可能。该平台不仅为汉坦病毒诊断树立新标准，更为应对未来新发传染病提供了可扩展的技术框架。研究团队特别指出，通过优化反应条件进一步协调多crRNA与扩增系统的协同作用，将是下一阶段技术转化的关键。