通过靶向代谢物转运重编程增强解脂耶氏酵母选择性合成衣康酸的策略研究

本研究针对衣康酸(IA)工业化生产面临的挑战，通过代谢工程改造解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，创新性地结合转运蛋白工程与通路多样化策略。研究人员通过失活内源性柠檬酸转运蛋白YlYHM2/YlCEX1阻断副产物分泌，同时引入黑曲霉(Aspergillus terreus)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的异源转运体(mttA/mtt1)与合成通路基因，首次在相同遗传背景下实现双通路协同表达。优化菌株在简单培养基中达到0.343 mol IA/mol葡萄糖的迄今最高酵母产量，为微生物细胞工厂的可持续生化生产开辟新途径。

　　

衣康酸(Itaconic acid, IA)作为一种具有α,β-不饱和双键的二羧酸平台化合物，被美国能源部列为12大生物基高附加值化学品之一。这种能替代丙烯酸的单体在合成树脂、医用高分子材料等领域应用广泛，预计2031年市场规模将达1.77亿美元。目前工业生产主要依赖土曲霉(Aspergillus terreus)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，但存在病原性风险、发酵条件苛刻、副产物多等瓶颈。意大利巴里大学等机构的研究团队选择非传统酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)作为宿主，这种GRAS(一般认为安全)微生物具有卓越的代谢可塑性，其线粒体碳通量约60%流向柠檬酸(CA)合成，为IA生产提供理想前体。相关成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》。

研究采用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建工程菌株，通过代谢通量分析和转运蛋白工程策略，结合分批补料发酵工艺评估生产性能。关键实验技术包括：1) 失活线粒体柠檬酸载体YlYHM2和质膜输出蛋白YlCEX1；2) 整合黑曲霉途径基因(cadA/mttA/mfsA)和玉米黑粉菌途径基因(adi1/tad1/mtt1/itp1)；3) 使用Golden Gate组装法构建多基因表达盒；4) 在2-L生物反应器中实施碳氮比(C/N)调控的补料策略。

增强线粒体CA池
通过删除线粒体柠檬酸-α-酮戊二酸载体基因YlYHM2，工程菌YM4B222的ICA分泌量提升至10.23±0.97 g/L，证实阻断线粒体输出可有效富集CA前体。

建立黑曲霉IA合成通路
在野生型背景(YM4B461)引入cadA(顺乌头酸脱羧酶)、mttA(线粒体转运体)和mfsA(质膜输出蛋白)后，IA产量达1.51±0.01 g/L，但CA/ICA副产物比为2.1。结合YlYHM2缺失的YM4B256菌株使IA产量提升1.9倍，揭示前体积累的关键作用。

通过YlCEX1缺失提升选择性
质膜柠檬酸输出蛋白YlCEX1的失活使YM4B324菌株完全消除副产物分泌，IA效价提升至8.03±0.53 g/L，证实膜转运调控对代谢通量再分配的决定性影响。

多基因插入优化
额外整合cadA拷贝的YM4B364菌株使IA产量提升18%，而同时过表达mttA的YM4B372菌株产量达10.84±0.18 g/L，说明线粒体转运能力是限速步骤。含双拷贝黑曲霉通路的YM4B374菌株创下12.91±0.17 g/L的纪录。

评估玉米黑粉菌通路
单独表达U. maydis途径基因的YM4B491菌株仅产0.09±0.03 g/L IA，但将其与黑曲霉通路组合的YM4B493菌株产量飙升至19.66±0.36 g/L，展现双通路协同效应。

补料发酵放大
在C/N=94的限氮条件下，YM4B493菌株以葡萄糖为底物时达到55.08 g/L IA，产率0.343 mol/mol，生产率0.256 g/L/h，且仅检测到微量琥珀酸副产物。

该研究通过创新性的"转运阻断+通路叠加"策略，首次在酵母中实现双物种IA合成途径的功能性耦合。相比前人工作，优化菌株在简化培养基中即达到商业化相关效价，且副产物控制显著优于传统生产菌。线粒体载体Scarcia等(2020)的动力学研究为转运蛋白工程提供理论支撑，而CRISPR/Cas9工具的应用则实现精准的多基因编辑。研究不仅创下酵母合成IA的产率新纪录，更开创了"代谢区室化+转运重编程"的通用工程范式，为其他三羧酸循环衍生化合物的生产提供借鉴。