脂质纳米颗粒介导CRISPR/Cas9系统靶向线粒体基因组编辑：攻克m.7778G>T突变相关线粒体疾病的新策略

本研究针对线粒体DNA（mtDNA）突变导致的疾病治疗难题，开发了基于MITO-Porter脂质纳米颗粒（LNP）的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）递送系统。通过微流控技术构建的RNP-MITO-Porter成功实现线粒体靶向递送，在携带m.7778G>T突变的细胞模型中证实可特异性切割突变mtDNA，为线粒体基因组编辑提供了创新工具，具有重要临床转化价值。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其基因组突变可导致多种毁灭性疾病。尽管CRISPR/Cas9技术革新了核基因组编辑领域，但线粒体双层膜结构却成为难以逾越的屏障——此前几乎所有尝试都需要分别递送Cas9编码基因和sgRNA，效率低下且存在脱靶风险。更棘手的是，线粒体疾病的发病与异质性（heteroplasmy）密切相关，当突变mtDNA比例超过阈值时就会引发症状，传统方法难以精准调控这一平衡。

日本北海道大学药学院的Yuma Yamada团队在《Scientific Reports》发表突破性研究，他们开发的RNP-MITO-Porter系统首次实现CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合体的线粒体靶向递送。这项研究选择m.7778G>T突变作为概念验证靶点，该突变位于小鼠mt-Atp8基因，可导致ATP合成障碍。研究人员创新性地将微流控制备技术与线粒体膜融合机制相结合，使携带RNP的脂质纳米颗粒像特洛伊木马般穿越线粒体双层膜。

关键技术包括：1）微流控装置（iLiNP）制备均质化RNP-MITO-Porter；2）stearylated-octaarginine（STR-R8）修饰实现线粒体靶向；3）比较性定量PCR（qPCR）评估mtDNA切割效率；4）使用携带m.7778G>T突变的LMSF-N-MTFVB小鼠成纤维细胞模型验证治疗效果。

【Design of SgRNAs targeting specific human and mouse mitochondrial genes】
研究团队针对人类MT-TL1基因和小鼠mt-Atp8基因设计特异性sgRNA。体外实验显示，两种RNP复合物均能剂量依赖性切割450bp人工基因片段，为后续线粒体递送奠定基础。

【Construction of an RNP-MITO-Porter using a microfluidic device】
通过优化微流控参数（流速比450:50 μL/min），成功制备粒径约70nm、包封率25-32%的RNP-MITO-Porter。关键突破在于发现去除DMG-PEG₂₀₀₀可避免颗粒聚集，这颠覆了传统LNP设计理念。

【Evaluation of MtDNA cleavage activity in isolated mitochondria】
在分离的HeLa细胞线粒体中，RNP-MITO-Porter展现出浓度依赖性切割效率（最高75%），显著优于商业转染试剂Lipofectamine。证明MITO-Porter能保护RNP活性并实现序列特异性切割。

【Verification of MtDNA cleavage in HeLa cells】
共聚焦显微镜显示DiI标记的RNP-MITO-Porter与MitoTracker共定位。转染1.5小时后即检测到20%的mtDNA切割，证实快速起效特性，但6小时后效率下降，提示切割后mtDNA降解动态。

【Verification of MtDNA cleavage in LMSF-N-MTFVB cells】
在疾病模型细胞中，流式细胞术证实时间依赖性内化，24小时后仍保持线粒体定位。qPCR显示靶向mt-Atp8的RNP-MITO-Porter使突变mtDNA拷贝数降低35%，而裸RNP无此效果。

这项研究开创性地证明：1）LNP可递送功能性RNP复合体跨越线粒体双层膜；2）膜融合策略优于传统转染方法；3）单次给药即可显著降低突变mtDNA负荷。尽管存在切割效率随时间衰减等问题，但该技术为近百种致病性mtDNA突变提供了通用治疗平台。特别值得注意的是，研究采用临床转化友好的微流控生产工艺，且首次在天然突变模型中验证疗效，为推进线粒体基因治疗临床试验奠定坚实基础。未来通过优化sgRNA设计提高突变特异性，结合异质性调控策略，或将彻底改变线粒体疾病的治疗格局。