离心力驱动微流控系统中RPA-CRISPR可视化自检沙门氏菌技术的开发与应用

本研究针对食品中沙门氏菌检测存在的操作复杂、耗时长等问题，开发了基于离心力驱动微流控系统的RPA-CRISPR可视化检测技术。通过将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR-Cas12a系统集成于芯片，实现了37°C下50分钟内检测1×100 CFU/mL沙门氏菌的灵敏度，无需专业设备即可完成现场检测，为食品安全监测提供了创新解决方案。

　　

沙门氏菌作为全球食源性疾病的主要致病菌，每年造成数亿人感染。传统培养法需1-2天，PCR等分子检测技术又依赖昂贵设备和专业操作，难以满足基层快速检测需求。近年来，CRISPR基因编辑系统因其"基因剪刀"特性被用于核酸检测，但存在开盖污染风险；重组酶聚合酶扩增(RPA)虽能实现快速等温扩增，但与CRISPR联用时易发生非特异性切割。如何实现闭管操作、简化流程成为技术突破的关键。

浙江省重点研发计划支持的研究团队在《Food Microbiology》发表论文，创新性地将离心力驱动微流控技术与RPA-CRISPR系统结合。通过精密设计的芯片结构，使RPA扩增室与CRISPR检测室物理隔离，利用离心力自动输送反应液，配合便携式荧光观测装置，构建了从样本到结果的闭环检测系统。

关键技术包括：1) 离心力驱动微流控芯片设计，实现液体自动传输；2) RPA与CRISPR-Cas12a反应体系优化，避免交叉干扰；3) 6-FAM-TTATT-BHQ1荧光报告系统构建，实现肉眼可视检测；4) 针对沙门氏菌invA基因设计crRNA引物。实验使用6种常见食源性病原体（含沙门氏菌ATCC 14028）验证特异性。

【材料与试剂】
研究选用沙门氏菌等6种标准菌株，采用Anpu Future公司的RPA试剂盒和New England Biolabs的Cas12a酶，通过invA基因特异性引物实现靶标识别。

【工作原理】
如图1所示，预装试剂的芯片在离心力作用下，RPA扩增产物自动进入CRISPR检测室。Cas12a在crRNA引导下识别靶DNA后，激活非特异性切割活性，切断荧光报告分子产生信号。该系统通过蓝光激发即可肉眼判读，避免复杂仪器。

【结论】
该技术实现50分钟内检出1×10⁰
CFU/mL沙门氏菌，对金黄色葡萄球菌等近缘菌种无交叉反应。田间试验显示，无需专业设备即可完成检测，假阳性率显著低于传统开管操作。

讨论指出，该研究首次将离心力驱动与RPA-CRISPR技术整合，解决三大技术痛点：1) 通过微流控芯片物理隔离避免气溶胶污染；2) 离心力驱动替代复杂外接设备；3) 可视化设计降低使用门槛。作者Dafeng Song团队强调，该系统成本不足传统PCR设备的1/10，特别适合基层食品安全监测，未来可拓展至其他食源性病原体检测。研究获浙江省"领雁计划"（2022C03091）支持，相关技术已申请专利。