分级加载微孔芯片实现单细胞分泌蛋白的多重检测技术研究

研究人员针对单细胞分泌蛋白检测通量低、细胞利用率不足等问题，开发了基于分级加载微孔芯片（HL-Chip）的多重检测技术。该技术通过精确配对单细胞与抗体微珠，实现了6种细胞因子（如IL-2、IFN-γ）的高效同步检测，揭示了TCR-T细胞的早期细胞因子爆发和功能异质性，为免疫细胞功能评估提供了新工具。

　　

研究背景
细胞分泌的蛋白质（如细胞因子、趋化因子）是免疫调控、疾病发展的关键介质。然而，传统检测方法如ELISA（酶联免疫吸附试验）和流式细胞术（flow cytometry）仅能反映群体平均水平，掩盖了单细胞水平的异质性。尽管微流控技术（microfluidics）通过微孔或微腔室实现了单细胞分析，但存在细胞装载效率低（遵循泊松分布）、检测通量有限（≤3种蛋白）等瓶颈。例如，微雕刻技术（microengraving）和单细胞条形码芯片虽能提升检测灵敏度，但细胞浪费率高达70%以上。如何实现高效单细胞捕获与多重蛋白同步检测，成为免疫学研究的重要挑战。

技术方法
中国科学院的研究团队开发了升级版分级加载微孔芯片（HL-Chip）。该芯片采用三连孔设计（25 μm、11/16 μm、20 μm），通过顺序加载大微珠（21.9 μm，包被3种抗体）、单细胞和小微珠（5.5 μm，包被另3种抗体），实现空间和光谱双重编码。利用抗原肽刺激TCR-T（T细胞受体工程化T）细胞和巨噬细胞，通过荧光信号定量6种细胞因子（如IFN-γ⁺
、TNF-α⁺
）。

研究结果

1. HL-Chip的设计与验证
芯片包含10,000个三连微孔单元，单细胞与微珠配对效率>90%。大微珠和小微珠分别包抗IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ、TNF-α、Granzyme B抗体，通过位置（大/小孔）和荧光颜色（4色）实现6重检测。

2. T细胞分泌异质性分析
CD4⁺
和CD8⁺
T细胞经PMA/离子霉素刺激后，检测到早期（6小时）IL-2⁺
和IFN-γ⁺
细胞比例达峰值，24小时后下降，表明瞬时分泌爆发。TCR-T细胞在抗原肽刺激下呈现多功能性（polyfunctional），即同时分泌2-3种细胞因子的亚群占比显著升高。

3. 巨噬细胞极化研究
LPS/IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞高表达TNF-α⁺
和IL-6⁺
，而IL-4诱导的M2型以IL-4⁺
为主，证实平台可区分不同极化状态。

结论与意义
该研究通过HL-Chip实现了单细胞分泌蛋白的6重检测，解决了传统技术通量低、细胞浪费严重的问题。发现TCR-T细胞的早期细胞因子爆发和功能异质性，为优化免疫疗法提供了新依据。相关成果发表于《Biosensors and Bioelectronics》，为临床免疫监测和基础研究提供了高效工具。