荧光素-叶酸双特异性适配体桥接的CAR免疫细胞鸡尾酒疗法：一种新型实体瘤免疫治疗策略

本研究针对实体瘤免疫抑制微环境(TME)限制免疫细胞疗法疗效的难题，创新性地开发了由人多能干细胞(hPSC)分化的CAR中性粒细胞(PMN)与CAR自然杀伤细胞(NK)组成的免疫细胞鸡尾酒疗法。通过CRISPR/Cas9在AAVS1安全港位点整合抗FITC-CAR，结合双特异性适配体(FITC-叶酸)定向激活，显著增强免疫突触形成和肿瘤杀伤能力，并在缺氧TME中维持抗肿瘤表型。该研究为实体瘤治疗提供了可规模化生产的"即用型"细胞疗法方案，发表于《Bioactive Materials》。

　　

在肿瘤治疗领域，CAR-T细胞疗法虽在血液肿瘤中取得突破，却难以攻克实体瘤堡垒——这主要归咎于肿瘤微环境(TME)的免疫抑制特性。传统疗法面临三大困境：免疫细胞易被TME"驯化"为促癌表型；单一细胞疗法难以应对肿瘤异质性；外源性细胞因子易引发毒副作用。如何突破这些瓶颈？香港理工大学的研究团队独辟蹊径，将目光投向人体最丰富的先天免疫细胞——中性粒细胞(PMN)与"天然杀手"NK细胞的黄金组合，通过干细胞工程与合成生物学技术，构建出具有协同杀伤效应的免疫细胞鸡尾酒疗法，相关成果发表在《Bioactive Materials》。

研究团队采用CRISPR/Cas9将抗荧光素(FITC)的CAR结构精准整合至H9 hPSC的AAVS1安全港位点，通过化学限定性分化体系获得CAR-PMN和CAR-NK细胞。关键技术包括：AAVS1位点靶向整合、阶段特异性形态因子诱导分化、双特异性适配体(FITC-叶酸)桥接技术，以及缺氧条件下(3% O₂
)的功能验证。

AAVS1靶向抗FITC CAR修饰hPSC
通过同源重组将包含CD8α信号肽、抗FITC scFv、4-1BB共刺激域和CD3ζ激活域的CAR结构整合至hPSC基因组，获得69%杂合子和31%纯合子克隆。修饰后的hPSC保持OCT-4和SSEA-4表达，证明基因操作未影响干性。

化学限定条件高效产生功能性PMN
采用CHIR99021激活Wnt通路诱导CD34⁺
CD31⁺
造血内皮，经SB431542促进内皮-造血转化，最终通过G-CSF和AM580分化为成熟PMN。所得细胞高表达CD16、CD11b等标志物，并保持稳定CAR表达，每hPSC可产生约20个PMN。功能验证显示其具有趋化迁移(fMLP诱导下迁移率提升3倍)、ROS爆发(PMA刺激后增加2.5倍)等关键特性。

FITC-叶酸桥接增强肿瘤杀伤
双特异性适配体(FITC-叶酸)巧妙连接CAR-PMN与叶酸受体α(FRα)高表达的MDA-MB-231细胞，结合亲和力K_d
达8.83 nM。共培养实验显示：CAR-PMN与肿瘤细胞免疫突触数量增加4倍；在效应靶比5:1时，杀伤效率达75%，较野生型PMN提升40%。值得注意的是，该体系对FRα阴性的LNCaP细胞无杀伤作用，证实靶向特异性。

缺氧TME中的功能维持
在模拟实体瘤的3% O₂
条件下，CAR-PMN仍保持N1型抗肿瘤表型(ICAM-1、iNOS高表达)，而野生型PMN则转为N2型促瘤表型(CCL2、VEGF上调)。Western blot揭示其机制：CAR激活显著增强Syk-Erk信号通路磷酸化(p-Syk/p-Erk1/2增加2倍)，克服缺氧导致的信号抑制。

PMN-NK细胞协同效应
CAR-PMN通过分泌TNF-α(浓度提升3倍)促进CAR-NK细胞浸润(Transwell迁移数增加2倍)；而CAR-NK释放的IFN-γ又可维持CAR-PMN活性。这种正反馈使联合治疗组在体内实验中肿瘤抑制率达80%，显著优于单细胞治疗组(p<0.001)。

这项研究开创性地将hPSC分化、基因编辑与双特异性适配体技术相结合，突破传统细胞疗法三大局限：通过干细胞分化解决细胞来源问题；利用适配体实现精准靶向；借助细胞间协同克服TME抑制。尤为重要的是，该策略无需外源性细胞因子即可维持疗效，为实体瘤治疗提供可规模化生产的"即用型"解决方案。未来研究可进一步探索不同免疫细胞比例优化、适配体药代动力学改进等方向，推动该技术向临床转化。